結核分枝桿菌Ag85A DNA 疫苗的免疫原性和治療作用

梁 艷，吳雪瓊，，張俊仙，陽幼榮，李忠明

結核病(tuberculosis，TB)一直是備受關注的一個全球性健康問題。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，全球約有1/3 人口感染結核分枝桿菌(mycobacterium tuerculosis，Mtb)，全世界每年都有新發(fā)結核病例830萬，死亡病例180 萬［1］。我國患結核病人數(shù)位居世界第二，每年新增結核病患者約150 萬，受感染人數(shù)約4.5 億。結核病的疫情給結核病的防治提出了新的挑戰(zhàn)，結核病的免疫治療成為研究的熱點之一，治療性疫苗的研究與開發(fā)成為一個十分重要的研究方向。在前期研究中筆者以載體CMV blue 構建了結核分枝桿菌Ag 85A DNA 疫苗［2］，發(fā)現(xiàn)該疫苗對結核病具有一定的免疫治療效果。鑒于載體CMV blue 不能用于人，而采用美國FDA 建議的可用于人的質粒載體pVAX1 重新構建了結核分枝桿菌Ag 85A DNA 疫苗。本研究通過動物實驗評價pVAX1－Ag85A DNA 疫苗的免疫原性和對小鼠結核病的治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 DNA 疫苗和菌株來源 質粒載體pVAX1和結核分枝桿菌Ag85A DNA 疫苗由上海海規(guī)生物科技有限公司純化，濃度均為1 mg/ml，純度較高(A260/A280 = 2.06 ＞1.80)，幾乎不含蛋白和RNA。結核分枝桿菌標準株H37Rv 由中國藥品生物制品檢定所提供;微卡菌苗購自安徽龍科馬生物制藥有限責任公司，規(guī)格22.5 μg/支。

1.1.2 藥物和實驗動物 利福平膠囊購自沈陽紅旗制藥有限公司，規(guī)格0.15 g;80 只6 ～8 周齡雌性BALB/c 小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.1.3 試劑盒 ELISPOT 試劑盒購自BD 公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA 疫苗的免疫原性

1.2.1.1 動物免疫分組 分為4 組，每組10 只小鼠。生理鹽水組每只小鼠肌肉注射100 μl 生理鹽水;pVAX1 載體組每只小鼠肌肉注射100 μg/100 μl pVAX1 載體;微卡菌苗組每只小鼠肌肉注射22.5 μg/100 μl 微卡菌苗;Ag85A DNA 疫苗組每只小鼠肌肉注射100 μg/100 μl Ag85A DNA 疫苗。各組小鼠每2 周肌肉注射1 次，共注射3 次。

1.2.1.2 酶聯(lián)免疫斑點試驗(ELISPOT) 小鼠第3 次免疫后14 d 殺鼠取脾臟，分離脾細胞，調節(jié)脾淋巴細胞濃度為4 ×106/ml。在測試板中，分別加入培養(yǎng)液、重組Ag85A 蛋白(終濃度為5 μg/ml)、植物血凝素(PHA)(終濃度為10 μg/ml)，脾淋巴細胞為4 × 105/孔，置CO2溫箱中于37 ℃溫育48 h，用ELISPOT 方法檢測各組分泌IFN－γ 的T 淋巴細胞斑點數(shù)，以各組小鼠空白對照孔為對照，計算各組小鼠檢測孔的細胞斑點數(shù)，按試劑盒說明書進行操作。

1.2.2 DNA 疫苗的治療作用

1.2.2.1 小鼠結核病感染模型的制備 每只小鼠經(jīng)尾靜脈注射0.4 ml 含6.8 ×104的結核分枝桿菌標準株H37Rv 懸液，制備結核病模型。

1.2.2.2 實驗分組 小鼠感染后，將小鼠隨機均勻地分為4 組，每組10 只小鼠。小鼠感染后第3 天開始，生理鹽水組每只小鼠肌肉注射100 μl 生理鹽水;pVAX1 載體組每只小鼠肌肉注射100 μg/100 μl pVAX1 載體;利福平組每只小鼠口服利福平0.02 mg/(kg·d);Ag85A DNA 疫苗組每只小鼠肌肉注射100 μg/100 μl Ag85A DNA 疫苗。各治療組每2周肌肉注射1 次，共注射3 次。

1.2.2.3 肺組織病理學檢查 在治療結束后2周，將小鼠肺右葉固定于10%中性甲醛，石蠟包埋切片，蘇木精/伊紅(HE)染色后，鏡下觀察肺組織病理改變。

1.2.2.4 肺、肝菌落計數(shù) 在治療結束后2 周，取小鼠肺左葉稱重，加生理鹽水研磨，加等體積6%NaOH 消化30 min 后，倍比稀釋取100 μl 接種于改良羅氏雞卵平皿培養(yǎng)液上，置37℃溫箱培養(yǎng)4 周，將得到的肺左葉菌落數(shù)根據(jù)肺左葉和全肺的重量換算為全肺菌落數(shù);取部分肝稱重，加生理鹽水研磨，倍比稀釋后取100 μl 接種于改良羅氏雞卵平皿培養(yǎng)液上，置37℃溫箱培養(yǎng)4 周，將得到部分肝的菌落數(shù)根據(jù)其重量和全肝的重量換算為全肝菌落數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SAS6.12 軟件處理數(shù)據(jù)，正態(tài)分布的定量資料用單因素方差分析，兩兩比較用t 檢驗;偏態(tài)分布的定量資料用秩和(Kruskal－Wallis)檢驗，兩兩比較用q(Student－Newman－Keuls)檢驗。

2 結果

2.1 小鼠分泌IFN－γ 的T 淋巴細胞斑點數(shù)pVAX1 載體組和微卡菌苗組均可見少量Ag85A 特異的分泌IFN－γ 的T 淋巴細胞，生理鹽水組未見;而Ag85A DNA 疫苗組可見大量Ag85A 特異的分泌IFN－γ 素的T 淋巴細胞(圖1)。與其他組相比，Ag85A DNA 疫苗能誘導產(chǎn)生大量的分泌IFN－γ 的T 淋巴細胞(S =11.832，P =0.0080)，表明Ag85A DNA 疫苗顯著增強小鼠特異的細胞免疫功能。

2.2 肺臟組織病理改變 治療結束后2 周，各治療組小鼠肺組織的鏡下病理改變見圖2。生理鹽水組肺組織病變嚴重、廣泛，實變，肺泡結構破壞顯著，肺泡壁重度腫脹、增厚，可見少量的淋巴細胞浸潤。pVAX1 載體組病變程度比生理鹽水組稍輕，肺泡壁中度、重度增厚，小部分區(qū)域肺泡結構完整。利福平組無病變，肺泡結構完整，清晰，肺泡上皮延續(xù)。Ag85A DNA 疫苗組肺組織病變較局限，以肉芽腫樣增生性病變?yōu)橹鳎?/5 區(qū)域肺泡結構完整，清晰，肺泡上皮延續(xù)。病變區(qū)域出現(xiàn)典型的由類上皮細胞、多核巨細胞、泡沫樣細胞和少量淋巴細胞組成的結核肉芽腫。

圖2 各組小鼠肺組織病理結果(HE，×40)

2.3 肺、肝活菌計數(shù) 治療結束后2 周，治療組全肺菌落數(shù)由多到少依次是生理鹽水組、pVAX1 載體組、Ag85A DNA 疫苗組和利福平組，分別為(6.41 ±0.25)log、(6.16 ±0.35)log、(5.68 ±0.40)log 和(4.30 ±0.44)log。與生理鹽水組比較，pVAX1 載體組肺臟菌落數(shù)略有減少，但差別無統(tǒng)計學意義;利福平組、Ag85A DNA 疫苗組肺臟菌落數(shù)分別減少2.11 log 和0.73 log(P ＜0.01)。全肝菌落數(shù)由多到少依次是生理鹽水組、pVAX1 載體組、Ag85A DNA 疫苗組和利福平組，分別為(5.53 ±0.31)log、(5.47 ±0.29 )log、(4.65 ±0.23)log 和(3.42 ±0.44 )log。與生理鹽水組比較，pVAX1 載體組肝臟菌落數(shù)略有減少，但差別無統(tǒng)計學意義;利福平組、Ag85A DNA 疫苗組肝臟菌落數(shù)分別減少了2.11 log和0.88 log(P ＜0.01)。

3 討論

DNA 疫苗由能引起機體保護性免疫應答的病原體抗原的編碼基因和載體組成，將其直接導入機體細胞后，并不與宿主染色體整合，而是通過宿主細胞的轉錄系統(tǒng)表達蛋白抗原，誘導宿主產(chǎn)生細胞免疫應答和體液免疫應答。很多研究表明DNA 疫苗可以刺激機體產(chǎn)生并長期維持所需的細胞免疫應答，與抗結核化療相結合不僅可提高機體免疫力，而且可以提高化療效果，縮短療程［2－7］，因而可能成為結核病治療的新途徑。

Ag85A 是結核分枝桿菌和BCG 主要的分泌性蛋白，Denis［3］研究了Ag85A DNA 疫苗免疫的BALB/c 小鼠的抗原特異性CD4+和CD8+T 細胞反應，證實Ag85A DNA 免疫疫苗可產(chǎn)生更強、更廣泛的T 細胞反應和CTL 活性。Huygen［4］報道，用Ag85 復合物編碼基因免疫小鼠，可誘導產(chǎn)生很強的細胞和體液免疫反應，抵御活結核分枝桿菌和卡介苗的攻擊。近年來國內外學者在結核DNA 疫苗方面進行了一系列的研究，其中在Ag85A DNA 疫苗上取得了良好的實驗效果［2－8］。因此本文在前期研究的基礎上，進一步評價Ag85A DNA 疫苗治療小鼠結核病的療效。

IFN－γ 常被認為是抵抗結核分枝桿菌感染的一個關鍵性細胞因子，也是Th1 型細胞免疫反應的重要指標，基因免疫抗結核病的保護性效應與分泌IFN－γ 的淋巴細胞的產(chǎn)生密切相關［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，從分泌IFN－γ 的T 淋巴細胞數(shù)看，與其他組比較，Ag85A DNA 疫苗能誘導產(chǎn)生大量的分泌IFN－γ 的T 淋巴細胞，表明Ag85A DNA 疫苗顯著增強小鼠特異的細胞免疫功能。從肺、肝細菌載量來看，與生理鹽水組比較，Ag85A DNA 疫苗組肺臟活菌數(shù)和肝臟活菌數(shù)均有顯著減少，分別減少了0.73 log 和0.88 log，表明Ag85A DNA 疫苗對小鼠結核病具有顯著的治療作用。但其治療作用不如利福平，其原因可能在于Ag85A DNA 疫苗是通過增強機體的細胞免疫功能間接抑制結核菌的生長，而利福平是全殺菌藥，可以直接殺滅結核菌。從肺臟病損程度和組織病變評價，與生理鹽水組和載體組病變嚴重、廣泛相比，Ag85A DNA 疫苗組肺臟病變減輕，病變局限，3/5 區(qū)域可見肺泡結構完整，清晰，且與肺菌落計數(shù)相一致。以上研究結果表明，Ag85A DNA 疫苗對小鼠結核病具有一定的治療作用。在前期研究中，筆者用Ag85A DNA 疫苗治療小鼠耐多藥結核病模型，發(fā)現(xiàn)Ag85A DNA 疫苗對耐多藥結核病也有療效［7，8］。

綜上所述，Ag85A DNA 疫苗主要刺激Th1 型的免疫反應，能顯著增強小鼠特異的細胞免疫功能，有望成為治療結核病新的免疫制劑，為臨床上結核病治療開辟一條新途徑。

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［2］ 吳雪瓊，張俊仙，李洪敏，等. 結核分枝桿菌Ag85A DNA 疫苗免疫治療作用的研究［J］. 中國免疫學雜志，2002，18(1):17－22.

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［4］ Huygen K，Content J，Denis O，et al. Immunogenicity and protective efficacy of a tuberculosis DNA vaccine［J］. Nat Med，1996，2(8):893－898.

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