HPLC 法同時測定復方克霉唑乳膏中2 種成分的含量

柳 杰，陳艷偉，辛翠群，王春富*

復方克霉唑乳膏為我院制劑，由克霉唑和丙酸氯倍他索加適量基質(zhì)制成。復方克霉唑乳膏屬于抗真菌藥，皮膚科主要用于治療皮膚癬病、急慢性濕疹、脂溢性皮炎等皮膚病。為了有效地控制產(chǎn)品質(zhì)量，筆者通過參考相關(guān)文獻［1-4］，摸索實驗條件，建立了同時測定制劑中克霉唑和丙酸氯倍他索含量的高效液相色譜方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 日本島津LC-2010C HT 高效液相色譜儀，伊利特Hypersil BDS-C18色譜柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm)，UV Detector 檢測器，LC Solution工作站;賽多利斯儀器(北京)有限公司萬分之一分析天平;DelTA320PH 計;SK-1 快速型混勻器;HH-W420 數(shù)顯三用恒溫水箱;津騰溶液過濾器。

1.2試藥克霉唑?qū)φ掌?批號:100037-200306)，丙酸氯倍他索對照品(批號:100302-200602)，均購于中國藥品生物制品檢定所;復方克霉唑乳膏(克霉唑30 mg/g，丙酸氯倍他索0.5 mg/g)，大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院制劑室，批號:20110807、20110808、20110809;克霉唑，廣州市漢普醫(yī)藥有限公司，批號:國藥準字H44022613;丙酸氯倍他索，天津天藥業(yè)股份有限公司，批號:NCBP100902;乳膏基質(zhì)，天津市天驕制藥有限公司，批號:2011502;蒸餾水，自制蒸餾水，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過;磷酸二氫鉀(分析純)，沈陽市新西試劑廠，批號:20070520;磷酸(分析純)，天津市化學試劑六廠，批號:840404;甲醇(色譜純)，美國天地公司，批號:1010910。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為伊利特Hypersil BDSC18柱(4.6 mm × 150 mm，5 μm);流動相為0.05 mol/mL磷酸二氫鉀溶液(用10%磷酸調(diào)節(jié)pH 值至3.8)-甲醇-乙二胺(25∶75∶0.2);流速為0.8 mL/min;檢測波長為240 nm;柱溫為30 ℃;進樣量20 μL。理論塔板數(shù)克霉唑峰和丙酸氯倍他索峰均不低于5 000，克霉唑峰和丙酸氯倍他索峰的分離度大于2。

2.2 復方克霉唑乳膏的處方 克霉唑粉30 g;丙酸氯倍他索粉0.5 g;乳劑基質(zhì)加至1 000 g。

2.3 溶液的制備

2.3.1 流動相溶液的制備 稱取磷酸二氫鉀6.81 g，置于1 000 mL 容量瓶中，加水溶解定容至刻度，超聲5 min，用溶液過濾器過濾。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取克霉唑?qū)φ掌?2 mg 和丙酸氯倍他索對照品11 mg，分別置于10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得濃度為1.20 mg/mL 克霉唑儲備液和1.10 mg/mL丙酸氯倍他索儲備液。分別取3 mL 克霉唑儲備液和50 μL 丙酸氯倍他索儲備液，置于10 mL 容量瓶中，加入4.5 mL 甲醇，以水定容，即得克霉唑和丙酸氯倍他索濃度分別為360 μg/mL 和5.50 μg/mL的混合對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 精密稱取復方克霉唑乳膏1 g(約相當于克霉唑30 mg 和丙酸氯倍他索0.5 mg)，置于100 mL 容量瓶中，加甲醇75 mL，置于70 ℃水浴中加熱5 min，時時振搖，取出后強烈振搖5 min，放至室溫，加水至接近容量瓶刻度線，放至室溫后以水定容，搖勻，置冰箱中冷藏2 h，取出后先搖勻，立即用孔徑0.2 μm 濾膜過濾，取續(xù)濾液放至室溫，取20 μL 進樣。

2.3.4 空白溶液的制備 取空白乳膏基質(zhì)1 g，按“2.3.3”項下制備，取20 μL 進樣。

2.4 干擾試驗 按“2.1”項下的色譜條件，分別取空白溶液、對照品溶液及供試品溶液適量進樣，記錄色譜圖，結(jié)果如圖1。各峰之間分離度良好，結(jié)果表明，空白基質(zhì)對克霉唑和丙酸氯倍他索測定無干擾。

2.5 線性關(guān)系考察 精密量取“2.3.2”項下方法配制的克霉唑和丙酸氯倍他索混合對照品溶液，分別進樣5、10、20、30 和40 μL，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖，分別以克霉唑和丙酸氯倍他索的質(zhì)量濃度(X，μg/mL)為縱坐標，以峰面積(Y)為橫坐標，做標準曲線，進行回歸分析。結(jié)果表明，克霉唑和丙酸氯倍他索分別在90.0 ～720.0 μg/mL和1.38 ～11.0 μg/mL 濃度范圍線性關(guān)系良好，回歸方程分別為Y =1.28 ×10-4X-14.6(r =0.999 8)，Y =183 ×10-5X + 2.40 ×10-2(r=0.999 9)。

2.6 精密度試驗 精密量取“2.3.2”項下方法配制的克霉唑和丙酸氯倍他索混合對照品溶液20 μL，按“2.1”項色譜條件重復進樣6 次。結(jié)果克霉唑和丙酸氯倍他索的RSD 分別為0.5% 和1.6%。表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 精密量取同一供試品溶液20 μL，在“2.1”項下色譜條件下，分別于0、1、2、4 h進樣，記錄色譜圖。結(jié)果克霉唑和丙酸氯倍他索穩(wěn)定性RSD 分別為1.7%和0.2%。表明供試品溶液在4 h 內(nèi)穩(wěn)定。

圖1 三種溶液的HPLC 圖譜

2.8 重復性試驗 取同一份復方克霉唑乳膏，精密稱取6 份，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件進行平行測定。結(jié)果克霉唑和丙酸氯倍他索的重復性分別為0.6%和1.1%，表明此方法重復性良好。

2.9 回收率試驗 精密稱取丙酸氯倍他索對照品25 mg，置于25 mL 容量瓶中，加適量甲醇溶解并稀釋至刻度，得1 mg/mL 丙酸氯倍他索對照品溶液。精密稱取克霉唑?qū)φ掌?00 mg，置于100 mL容量瓶中，得3 mg/mL 克霉唑?qū)φ掌啡芤?。稱取9 份空白乳膏基質(zhì)約1 g，分別準確加入濃度為1 mg/mL 丙酸氯倍他索對照品溶液各400、500、600 μL 和濃度為3 mg/mL 克霉唑?qū)φ掌啡芤焊?、10、12 mL，每種濃度各3 份，分別置于100 mL 容量瓶中，按“2.3.3”項下方法制備，按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積，計算各自的回收率，結(jié)果如表1 所示。

表1 克霉唑和丙酸氯倍他索回收率試驗

樣品含量測定:取3 批復方克霉唑乳膏，各取3 個樣品，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，依“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算樣品的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品的含量測定

3 討論

在《中華人民共和國藥典》2010 年版二部中，克霉唑乳膏和丙酸氯倍他索均采用高效液相色譜法來進行含量測定。但兩者的色譜條件各不相同，前者以甲醇-0.05 mol/L 磷酸二氫鉀溶液(70∶30)(用10%磷酸調(diào)節(jié)pH 值至5.7 ～5.8)為流動相，檢測波長為215 nm;后者以甲醇-水(65∶35)為流動相，檢測波長則為240 nm。為了同時檢測復方克霉唑乳膏中的克霉唑和丙酸氯倍他索，筆者嘗試了以甲醇-0.05 mol/L 磷酸二氫鉀溶液(70 ∶30)(用10%磷酸調(diào)節(jié)pH 值至5.7)為流動相，發(fā)現(xiàn)在此條件下，克霉唑峰和丙酸氯倍他索峰不能與雜質(zhì)峰分離，而且克霉唑拖尾嚴重。經(jīng)過嘗試調(diào)節(jié)流動相pH 值，發(fā)現(xiàn)pH 值越小，保留時間越短，并且，加入0.2%的乙二胺后，有效抑制了克霉唑拖尾。最終確立以0.05 mol/L 磷酸二氫鉀溶液(10%磷酸調(diào)節(jié)pH 值至3.8)-甲醇-乙二胺(25∶75∶0.2)為流動相，克霉唑、丙酸氯倍他索與雜質(zhì)峰有效分離。由于樣品中丙酸氯倍他索含量較克霉唑少且響應較低，為同時測定克霉唑和丙酸氯倍他索，選擇了丙酸氯倍他索有較強吸收的240 nm 為檢測波長。

本法測得復方克霉唑乳膏中克霉唑和丙酸氯倍他索的含量分別為標示量的99.5%、98.2%，且操作簡便，結(jié)果準確，精密度高，可以同時測定復方克霉唑乳膏中的克霉唑和丙酸氯倍他索，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:102，320-321，580-581.

［2］ 王勇. HPLC 法測定復方克霉唑乳膏中二苯基-(2-氯苯基)甲醇和克霉唑的含量［J］. 中國藥品標準，2010，11(3):227-230.

［3］ 胡守蓮，范玉峰.HPLC 法測定丙酸氯倍他索尿素乳膏中丙酸氯倍他索的含量［J］.藥品鑒定，2009，6(22):74-75.

［4］ 李亦蕾，鐘震邦，鄭萍，等.高效液相色譜法測定復方酮氯乳膏中酮康唑和丙酸氯倍他索的含量［J］. 醫(yī)藥導報，2010，29(9):1216-1218.