纖維素酶提取洋蔥多糖工藝研究

傅冬和，李 適，蔡汶莉，吳遠(yuǎn)杰

（1.國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院植物資源工程系，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

“蔬菜皇后”洋蔥是集營(yíng)養(yǎng)、醫(yī)療和保健于一身的特色蔬菜，產(chǎn)量高，多糖等活性成分豐富。近幾年來(lái)，酶技術(shù)在多糖等生物活性物質(zhì)的提取中的應(yīng)用已引起廣泛關(guān)注，選擇理想的酶可以在較溫和的條件下分解植物組織，提高目標(biāo)物質(zhì)的提取率。纖維素是洋蔥細(xì)胞壁的主要成分，是阻礙其多糖等大分子物質(zhì)浸出的主要屏障，纖維素酶可破壞細(xì)胞壁，利于胞內(nèi)成分溶出，使多糖提取率明顯高于常規(guī)水提醇沉法[1]。目前洋蔥多糖提取工藝報(bào)道較多的主要有水提醇沉法、微波輔助凍融法和超聲波輔助浸提等[2-6]，用纖維素酶法提取的系統(tǒng)研究的相關(guān)報(bào)道還不多見。水是既環(huán)保又經(jīng)濟(jì)的一種溶劑，為此，該研究擬采用纖維素酶水解洋蔥細(xì)胞壁，以水作為溶劑浸提洋蔥多糖類化合物，通過(guò)系統(tǒng)研究以期獲得洋蔥多糖提取的最佳工藝，為洋蔥多糖的開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和儀器

試驗(yàn)材料為市售新鮮紫皮洋蔥。試驗(yàn)試劑包括：葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所），纖維素酶（活性單位大于50 000 U/g，銳陽(yáng)生物），濃硫酸、苯酚、95%乙醇、無(wú)水乙醇、丙酮（均為市售、國(guó)產(chǎn)、分析純）。

試驗(yàn)儀器為：UV-VIS紫外分光光度計(jì)（日本島津）；FA21045電子天平（上海精科天平廠）；H-2050R離心機(jī)（長(zhǎng)沙市八方科學(xué)儀器有限公司）；恒溫水浴鍋(北京國(guó)華醫(yī)藥器械廠)；循環(huán)水式多用真空泵（河南鞏義英峪予華儀器廠）；超聲波清洗機(jī)（上海BRANSON公司）；LGJ-10真空冷凍干燥機(jī)（亞星儀科）；常用玻璃器皿。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1洋蔥粗多糖的制備和檢測(cè)新鮮洋蔥洗凈去皮，切薄片后于-18℃的條件下緩凍一定時(shí)間，冷凍干燥，粉碎，過(guò)60目篩即得洋蔥粉。取洋蔥粉500.0 g，用5倍質(zhì)量體積的80%乙醇回流脫脂2次，每次2.0 h，抽濾，收集濾渣50℃烘干備用。準(zhǔn)確稱取脫脂洋蔥粉10.0 g，按1∶25的固液比加入蒸餾水，再加入一定量的纖維素酶，調(diào)節(jié)pH，在水浴鍋中一定溫度下浸提一定時(shí)間，滅酶活，4 000 r/min離心20 min，取上層清液。再采用減壓蒸餾濃縮提取液至50 mL，向濃縮液中加入4倍體積的95%乙醇進(jìn)行醇析，在冰箱中放置過(guò)夜，然后離心。沉淀物分別用丙酮和無(wú)水乙醇洗滌，揮干溶劑后冷凍干燥得洋蔥粗多糖，用于測(cè)定洋蔥多糖的提取率。洋蔥多糖的檢測(cè)方法為硫酸-苯酚法[7]。

1.2.2洋蔥多糖提取單因素試驗(yàn)按方法1.2.1，準(zhǔn)確稱取脫脂洋蔥粉10.0 g，提取溫度固定為50℃，固液比為 1∶25，pH 值為 5.5，提取 1 次，酶的添加量為洋蔥粉的0.2%，提取時(shí)間分別為1.5、2.0、2.5、3.0 h，以測(cè)定洋蔥多糖提取率為指標(biāo)，考查提取時(shí)間對(duì)洋蔥多糖提取率的影響。

按方法1.2.1，準(zhǔn)確稱取脫脂洋蔥粉10.0 g，固液比為1∶25，提取時(shí)間為2.5 h，pH值為5.5，提取1次，酶的添加量為洋蔥粉的0.2%，提取溫度分別為30、40、50、60℃，以測(cè)定洋蔥多糖提取率為指標(biāo)，考查提取溫度對(duì)洋蔥多糖提取率的影響。

按方法1.2.1，準(zhǔn)確稱取脫脂洋蔥粉10.0 g，提取溫度為50℃，固液比為1∶25，提取時(shí)間為2.5 h，提取1次，pH值為5.5，纖維素酶的添加量分別為洋蔥粉的0.1%、0.2%、0.3%、0.4%，以測(cè)定洋蔥多糖提取率為指標(biāo)，考查酶添加量對(duì)洋蔥多糖提取率的影響。

按方法1.2.1，準(zhǔn)確稱取脫脂洋蔥粉10.0 g，固定提取溫度為50℃，提取時(shí)間為2.5 h，固液比為1:25，提取1次，調(diào)節(jié)pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0，以測(cè)定洋蔥提取液多糖提取率為指標(biāo)，考查提取液pH值對(duì)洋蔥多糖提取率的影響。

1.2.3洋蔥多糖提取正交試驗(yàn)洋蔥多糖提取正交試驗(yàn)的因素分別為提取溫度、提取時(shí)間、纖維素酶的添加量及介質(zhì)pH值，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定各因素的水平，設(shè)計(jì)4因素3水平的L9（34）正交試驗(yàn)。

1.2.4驗(yàn)證試驗(yàn)及對(duì)比試驗(yàn)根據(jù)纖維素酶水解法提取洋蔥多糖的正交試驗(yàn)確定的提取時(shí)間、溫度、pH值及纖維素酶的添加量的工藝參數(shù)，料液比為1∶25，比較加與不加纖維素酶對(duì)洋蔥粉多糖的提取率的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

按照參考文獻(xiàn)[7]方法，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算獲得洋蔥多糖的線性方程為C=9.610 3 A-0.004 1（式中C為被測(cè)液中多糖含量，A為被測(cè)液吸光值），相關(guān)系數(shù)為R2=0.9992。

2.2 洋蔥多糖提取單因素試驗(yàn)

2.2.1提取時(shí)間對(duì)洋蔥多糖提取率的影響圖1顯示，提取時(shí)間在2.5 h以內(nèi)時(shí)，洋蔥多糖含量隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增加；提取2.5 h時(shí)，洋蔥多糖最高含量達(dá)9.50%；提取時(shí)間超過(guò)2.5 h后，提取率略有下降。提取初期，多糖因洋蔥細(xì)胞壁的破壞很容易浸出，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，浸出速度逐漸減慢，達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡后，延長(zhǎng)浸提時(shí)間，多糖的提取率沒有增加。

圖1 提取時(shí)間對(duì)洋蔥多糖提取率的影響

圖2 提取溫度對(duì)洋蔥多糖提取率的影響

2.2.2提取溫度對(duì)洋蔥多糖提取率的影響圖2顯示，提取溫度在30～50℃之間，洋蔥多糖提取率隨溫度的升高而增加，50℃時(shí)達(dá)到最大值9.54%；溫度在50℃以上時(shí)，多糖的浸出率下降。這主要是因?yàn)闇囟仍偕?，酶的活性下降，且可能有部分多糖分解，所以多糖提取率反而下降?/p>

2.2.3酶添加量對(duì)洋蔥多糖提取率的影響圖3顯示，洋蔥多糖的提取率隨酶的添加量的增加而升高；當(dāng)添加量為0.3%時(shí)，提取率增加到9.33%；實(shí)際上酶的后3種添加濃度下多糖的提取率差別很小。酶的量比較少時(shí)，洋蔥細(xì)胞壁破壞不夠，多糖浸出受阻；當(dāng)酶添加量達(dá)到一定量后，能夠較完全水解洋蔥細(xì)胞壁，有利于其多糖的釋放，提取率增加。

圖3 酶添加量對(duì)洋蔥多糖提取率的影響

2.2.4 pH值對(duì)洋蔥多糖提取率的影響圖4顯示，當(dāng)pH值為5.0時(shí)，洋蔥多糖的提取率最高，達(dá)到9.38%；pH值為6.0時(shí)，提取率略有下降，說(shuō)明在pH 5.0～6.0的范圍內(nèi)酶的活性變化不大；在其他的pH值的條件下，提取率均較低。

圖4 pH值對(duì)洋蔥多糖提取率的影響

2.3 洋蔥多糖提取的正交試驗(yàn)

在上述單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，為了確定洋蔥多糖的最佳提取參數(shù)，以10.0 g洋蔥粉為原料，料液比為1∶25，以提取時(shí)間、提取溫度、pH值和纖維素酶添加量4因素3水平設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，見表1。測(cè)定各處理的洋蔥多糖提取率，試驗(yàn)結(jié)果見表2。通過(guò)表2極差分析得出洋蔥多糖提取率的影響因素大小為：提取時(shí)間＞提取溫度＞pH值＞酶添加量。試驗(yàn)結(jié)果顯示洋蔥多糖最佳提取工藝條件為：A2B2C3D1，即酶添加量為0.2%，pH值為5.5，提取溫度為50℃，提取時(shí)間為2.5 h，此條件下提取測(cè)得洋蔥中多糖含量為9.71%。

表1 因素水平表

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.4 驗(yàn)證性試驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)所確定的洋蔥多糖的提取工藝參數(shù)條件，精密稱取6份脫脂洋蔥粉，均按固液比1∶25，在 pH 5.5、50℃的條件下提取 2.5 h，其中 3 份均加0.2%的纖維素酶，另3份均不加酶，分別取平均值計(jì)算洋蔥中多糖的提取率。結(jié)果顯示，加酶處理的多糖平均提取率為9.78%，不加酶處理的多糖平均提取率為4.91%。

3 討論與結(jié)論

通過(guò)正交試驗(yàn)系統(tǒng)研究，確定提取最佳工藝參數(shù)：酶的添加量為0.2%，pH值為5.5，提取溫度為50℃，提取時(shí)間為2.5 h，此條件下洋蔥多糖的提取率可達(dá)9.78%。

試驗(yàn)洋蔥干燥前先采用冷凍，冷凍時(shí)新鮮洋蔥細(xì)胞中水分膨脹，使細(xì)胞部分得到破壞，有利于多糖的提取，并能減少纖維素酶的使用量。

洋蔥的多糖含量高，且有良好的生物學(xué)活性，能增強(qiáng)免疫力以及有抗氧化等活性[8]，是一種很好的保健食品。用傳統(tǒng)的水提法提取洋蔥多糖的提取率低。研究結(jié)果表明，不用酶處理的洋蔥多糖提取率只有4.91%，而用纖維素酶水解細(xì)胞壁的方法提取，可以使洋蔥多糖的提取率提高達(dá)到9.78%，且反應(yīng)條件溫和、工藝簡(jiǎn)單易行、多糖得率提高近一倍。纖維素酶通過(guò)將細(xì)胞壁主要結(jié)構(gòu)成分纖維素分解為還原糖，有助于增加多糖的溶出，從而提高多糖的得率，因此酶解方法在洋蔥多糖的提取應(yīng)用中具有很強(qiáng)的優(yōu)越性。用本方法制備的多糖沒有經(jīng)過(guò)純化，只是粗多糖，如果進(jìn)一步純化提高純度，則活性更強(qiáng)，應(yīng)用價(jià)值更高，應(yīng)用前景將十分廣闊。本研究結(jié)果可為洋蔥多糖工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)，也為將來(lái)用現(xiàn)代高新技術(shù)開發(fā)洋蔥多糖的研究提供參考。

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