微波輔助萃取蠶沙葉綠素的工藝研究

鄧祥元，沙 鵬，高 坤

（江蘇科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212018）

蠶沙作為家蠶幼蟲食桑后的排泄物，具有較高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值。研究表明，蠶沙中葉綠素含量約0.8%～1.0%（干物質(zhì)量分?jǐn)?shù)），高于其他植物中葉綠素含量[1]。從蠶沙中萃取葉綠素具有純度高、成本低、操作方便等優(yōu)點(diǎn)。葉綠素是脂溶性卟啉類化合物。目前，葉綠素的萃取方法主要有有機(jī)溶劑法、超臨界CO2法、吸附樹脂法等[2]，其中超臨界CO2法能降低萃取時(shí)間，減少萃取劑使用量，但操作復(fù)雜、設(shè)備昂貴、成本較高，其應(yīng)用領(lǐng)域受限。而有機(jī)溶劑法直接利用葉綠素易溶于有機(jī)溶劑的特點(diǎn)，選用合適有機(jī)溶劑萃取并輔助了微波、超聲波或離子交換分離等手段來提高效率和純度，其中微波輔助法，與傳統(tǒng)方法相比具有穿透力強(qiáng)、選擇性高、萃取時(shí)間短、節(jié)約能源等優(yōu)點(diǎn)，是天然產(chǎn)物提取中有發(fā)展?jié)摿Φ男录夹g(shù)。葉綠素含量的測(cè)定方法主要有分光光度法、熒光分析法、活體葉綠素儀法、光聲光譜法和高效液相色譜法等[3]，其中分光光度法具有操作方便、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用葉綠素含量測(cè)定過程中。

本研究采用微波輔助法從蠶沙中萃取葉綠素，并利用分光光度法對(duì)葉綠素含量進(jìn)行測(cè)定，通過比較分析微波壓力、微波時(shí)間及微波功率等工藝參數(shù)對(duì)葉綠素萃取效率的影響，探索其最優(yōu)萃取工藝，為蠶沙葉綠素的進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持，也為蠶沙葉綠素的大規(guī)模工業(yè)化開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

蠶沙由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所養(yǎng)蠶室提供，自然晾干后，除去桑葉渣、石灰、沙子等雜質(zhì)，置于60℃烘箱中烘干，用粉碎機(jī)粉碎后，過40目標(biāo)準(zhǔn)篩，獲得干蠶沙粉，避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器和試劑

高通量密閉微波消解系統(tǒng)（CEM-MARS型，美國(guó)培安公司產(chǎn)品）；紫外-可見分光光度計(jì)（UV-1800PC型，購(gòu)自上海美譜達(dá)儀器有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9101-ISA型，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品）；手提式中藥粉碎機(jī)（DFT-50型，購(gòu)自山東青州三陽包裝設(shè)備有限公司）；所用試劑（上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）分析純?cè)噭?/p>

1.3 方法

1.3.1 葉綠素萃取方法

準(zhǔn)確稱取0.02 g干蠶沙粉，加入0.75 mL軟化劑Na2CO3（0.05 g·mL-1）以阻止葉綠素降解成脫鎂葉綠素[4]，以4 mL丙酮比乙醇為2∶1的混合溶液為萃取劑（料液比為1∶200），在微波輔助下萃取葉綠素，萃取結(jié)束后，利用常溫離心機(jī)以5 000 r·min-1離心5 min，取上清液于光徑為1 cm的比色皿中，用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度值，并利用Arnon法的修正公式計(jì)算葉綠素a的濃度，進(jìn)而比較不同工藝參數(shù)對(duì)蠶沙葉綠素萃取效率的影響。

1.3.2 單因素試驗(yàn)方法

以0.02 g蠶沙粉為原料，按1.3.1的方法萃取葉綠素，并以蠶沙葉綠素a的濃度為指標(biāo)，考察不同微波壓力、微波時(shí)間及微波功率等工藝參數(shù)對(duì)蠶沙葉綠素萃取效率的影響。

1.3.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)是研究多因素多水平的一種設(shè)計(jì)方法，根據(jù)正交性從全面試驗(yàn)中挑選出部分有代表性的點(diǎn)進(jìn)行試驗(yàn)，這些有代表性的點(diǎn)具備“均勻分散，齊整可比”的特點(diǎn)，是一種高效、快速、經(jīng)濟(jì)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以微波壓力、微波時(shí)間及微波功率等4因素設(shè)3水平（見表1），采用L9（34）的正交試驗(yàn)，設(shè)計(jì)9組工藝萃取條件，并以蠶沙葉綠素a的濃度為指標(biāo)，探索微波輔助法萃取蠶沙葉綠素的最優(yōu)工藝。

表1 蠶沙葉綠素萃取的L9（34）正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels design of L9(34)orthogonal tests for chlorophyll extraction from silkworm faeces

1.3.4 葉綠素濃度的測(cè)定方法

利用紫外-可見分光光度計(jì)，在663 nm和645 nm處測(cè)量所提蠶沙葉綠素的吸光度值，然后利用Arnon法的修正公式[5-7]進(jìn)行計(jì)算：

葉綠素a濃度（mg·L-1）：Ca=12.7A663-2.69A645

葉綠素a濃度（mg·g-1）：Ca'=

式中，V-萃取劑體積（mL）；n-稀釋倍數(shù)；m-樣品質(zhì)量（g）；Ca和Ca'均為葉綠素a濃度，單位分別為 mg·L-1和 mg·g-1；A645、A663分別代表在波長(zhǎng)為645和663 nm下的吸光度值，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波壓力對(duì)蠶沙葉綠素萃取效率的影響

比較微波壓力分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7和0.8 MPa時(shí)，不同微波壓力對(duì)蠶沙葉綠素萃取效率的影響。結(jié)果見圖1，結(jié)果表明，隨著微波壓力增大，葉綠素a濃度不斷升高，當(dāng)微波壓力為0.4 MPa時(shí)葉綠素a濃度達(dá)到最大值，當(dāng)微波壓力超過0.4 MPa后，葉綠素a濃度迅速降低。這主要是由于當(dāng)達(dá)到一定壓力后，溫度迅速升高，隨著溫度升高，溶劑選擇性變差[9]，蠶沙中除葉綠素外的一些其它雜質(zhì)被萃取出來；同時(shí)溫度越高，對(duì)蠶沙葉綠素的破壞作用越大，萃取劑的揮發(fā)也越快，造成萃取率的下降。因此在實(shí)際生產(chǎn)中，選擇0.4 MPa為微波壓力，能夠使萃取效率最大化。

圖1 微波壓力對(duì)蠶沙葉綠素萃取效率的影響Fig.1 Effect of different microwave pressures on chlorophyll extraction efficiency from silkworm faeces

2.2 微波時(shí)間對(duì)蠶沙葉綠素萃取效率的影響

設(shè)定10、20、30、40、50、60、70、80 s等8個(gè)微波時(shí)間點(diǎn)，比較研究不同微波萃取時(shí)間對(duì)蠶沙葉綠素萃取效率的影響結(jié)果見圖2。由圖2可知，萃取率隨著微波時(shí)間的增加而迅速增大，50 s達(dá)到最大值，說明微波處理加速了蠶沙葉綠素的浸出，隨時(shí)間的變化不顯著（P＞0.05），80 s后萃取率迅速下降（P＞0.01）。由于蠶沙葉綠素在原料與萃取劑之間的濃度差，推動(dòng)著蠶沙葉綠素?cái)U(kuò)散至原料固體表面并溶解進(jìn)入萃取劑。在萃取初始，兩相間濃度差較大，促進(jìn)了蠶沙葉綠素快速溶解并擴(kuò)散至萃取劑，隨時(shí)間的推移，蠶沙葉綠素在溶劑中的濃度不斷增大，濃度差逐漸變小，擴(kuò)散速度變慢，萃取一定時(shí)間后，兩相間濃度達(dá)到平衡，萃取過程基本完成，這時(shí)繼續(xù)延長(zhǎng)微波時(shí)間也并不能提高萃取率，反而會(huì)由于微波時(shí)間過長(zhǎng)而造成蠶沙葉綠素的損失、雜質(zhì)的溶出和溶劑的揮發(fā)[9]。因此選擇微波時(shí)間在50 s為較優(yōu)的工藝條件。

2.3 微波功率對(duì)蠶沙葉綠素萃取效率的影響

取0.02 g蠶沙粉，在微波壓力為0.4 MPa的條件下，設(shè)定50、100、200和300 W的微波功率，微波處理50 s后，測(cè)定蠶沙葉綠素的吸光度值（A663和A645），并計(jì)算葉綠素a的濃度，微波功率對(duì)蠶沙葉綠素萃取效率的影響結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著微波功率的增加，蠶沙葉綠素的萃取率逐漸升高，在高通量密閉微波消解系統(tǒng)所允許的最高功率范圍內(nèi)，未發(fā)現(xiàn)微波功率對(duì)蠶沙葉綠素萃取效率的負(fù)影響。由于隨著微波功率的增大，分子震動(dòng)加快，摩擦增加，有利于葉綠素等目標(biāo)成分的溶出，使葉綠素濃度較高；但由于受到儀器設(shè)備限制，本研究未能探討微波功率繼續(xù)增大是否會(huì)導(dǎo)致葉綠素濃度的進(jìn)一步提高，但從其他研究結(jié)果來看，微波功率的繼續(xù)增大會(huì)使葉綠素濃度增加的速率變慢，未出現(xiàn)負(fù)影響[10]。因此，選擇微波功率為300 W是較優(yōu)工藝條件。

圖2 微波時(shí)間對(duì)蠶沙葉綠素萃取效率的影響Fig.2 Effect of different microwave time on chlorophyll extraction efficiency from silkworm faeces

圖3 微波功率對(duì)蠶沙葉綠素萃取效率的影響Fig.3 Effect of different microwave output powers on chlorophyll extraction efficiency from silkworm faeces

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9（34）的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)一步考察微波壓力、微波時(shí)間、微波功率3個(gè)因素對(duì)萃取效率的影響。按照1.3.3中正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，其試驗(yàn)結(jié)果見表2。根據(jù)表2的試驗(yàn)結(jié)果，從極差（R）的大小來看，影響蠶沙葉綠素萃取效率的因素大小為：微波壓力＞微波功率＞微波時(shí)間，其最優(yōu)水平組合為：A2B3C3，即微波壓力為0.4 MPa、微波時(shí)間為60 s、微波功率為300 W。

此外，為了進(jìn)一步確定各因素對(duì)蠶沙葉綠素萃取率的影響程度，對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表2 蠶沙葉綠素萃取的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal tests for chlorophyll extraction from silkworm faeces

表3 蠶沙葉綠素萃取的正交試驗(yàn)方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal tests for chlorophyll extraction from silkworm faeces

從表 3 方差分析可知，F(xiàn)0.05＜FC＜FA＜F0.01，表明微波壓力和微波功率對(duì)蠶沙葉綠素萃取效率的影響是顯著性因素，而微波時(shí)間則對(duì)萃取效率無顯著性影響。因此，綜合考慮生產(chǎn)成本等因素，應(yīng)選擇的萃取工藝條件是微波壓力為0.4 MPa，微波時(shí)間為50 s，微波功率為300 W。

取3份蠶沙樣品，在選擇的工藝條件下進(jìn)行蠶沙葉綠素萃取試驗(yàn)，所得葉綠素a的濃度為14.325 mg·L-1，較其它條件下的葉綠素a濃度高。從而，最終確定微波輔助萃取蠶沙葉綠素的最優(yōu)工藝條件是微波壓力為0.4 MPa，微波時(shí)間為50 s，微波功率為300 W。

3 討論與結(jié)論

本研究以蠶沙為原料，采用微波輔助法萃取葉綠素，并以葉綠素a的濃度為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化微波輔助法的工藝條件。

a.盡管葉綠素a和b在結(jié)構(gòu)上有細(xì)微的差別，但在葉綠素萃取過程中，葉綠素a和葉綠素b濃度的變化趨勢(shì)基本一致，這與眾多研究的試驗(yàn)結(jié)果相同[7,11-12]，說明結(jié)構(gòu)上的差異并不影響萃取過程的進(jìn)行，但葉綠素a較葉綠素b的濃度高，葉綠素a/b值為3，而葉綠素a濃度容易測(cè)定、誤差較小，因此采用葉綠素a的濃度為指標(biāo)優(yōu)化蠶沙葉綠素的微波輔助法的萃取工藝。

b.微波壓力和微波功率是影響蠶沙葉綠素萃取效率的顯著性因素。本研究所得最優(yōu)微波壓力和微波功率較其他研究低[13]。而微波時(shí)間作為影響蠶沙葉綠素萃取的非顯著因素，其優(yōu)化結(jié)果與前人研究結(jié)果[13]一致。

用微波輔助法萃取蠶沙葉綠素，其最優(yōu)工藝條件為：微波壓力為0.4 MPa，微波時(shí)間為50 s，微波功率為300 W。在此最優(yōu)工藝條件下，蠶沙葉綠素a的濃度可達(dá)到14.325 mg·L-1。且與傳統(tǒng)的葉綠素萃取工藝相比，微波輔助法具有萃取時(shí)間短，萃取溫度低，工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，產(chǎn)品質(zhì)量高等優(yōu)點(diǎn)，可供工業(yè)生產(chǎn)蠶沙葉綠素參考。

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