抗纖軟肝膠囊微生物限度檢查方法的驗(yàn)證

楊巨華 付 鶯

湖北省中山醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 武漢 430033

抗纖軟肝膠囊是我院自制制劑，由多味中藥組成，具有活血化瘀、軟堅(jiān)的功效。主要用于治療肝纖維化，肝硬化等。處方中的海藻、丹參、當(dāng)歸尾有一定的抑菌作用［1－2］。如果直接按常規(guī)法做微生物限度檢查，其中污染的微生物生長(zhǎng)有可能被抑制，影響試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。為此，筆者查閱了有關(guān)文獻(xiàn)［3～4］，并按照《中國(guó)藥典》［5］的要求進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)，確定了抗纖軟肝膠囊微生物限度檢查方法，為抗纖軟肝膠囊的微生物限度檢查提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器設(shè)備 凈化工作臺(tái)、電熱恒溫培養(yǎng)(HHBIIS00.S型，)、真菌培養(yǎng)箱 (MJ－160B型)、均漿儀 (300～8000r/min)、電熱恒溫水浴鍋 (H.S.G－IC－2)、煤電兩用手提式壓力蒸汽滅菌 (XXQ.SG41.280A)、電子天平 (AE200)。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌種 枯草芽孢桿菌CMCC(B)63501、金黃色葡萄球菌 CMCC(B)26003、大腸埃希菌 CMCC(B)44102、白色念珠菌CMCC(F)98001、黑曲霉CMCC(F)98003，均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。

1.3 培養(yǎng)基及稀釋劑 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，膽鹽乳糖培養(yǎng)基(BL)，改良馬丁培養(yǎng)基，改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基，MUG培養(yǎng)基，曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基 (EMB)，均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，按干燥培養(yǎng)基瓶簽方法配制。PH 7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液，0.9%無菌氯化鈉溶液，按《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄方法配制。

1.4 樣品 抗纖軟肝膠囊:批號(hào):101213、110325、110505;由湖北省中山醫(yī)院制劑室生產(chǎn)。

2 細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)測(cè)定方法的建立及驗(yàn)證

2.1 菌液制備 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置35℃培養(yǎng)18～24h;接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)24～48h，然后分別用0.9%無菌氯化鈉溶液制備成每1mL含菌數(shù)為50～100cfu/mL的菌懸液，備用;接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁斜面瓊脂培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)5～7d，加入3～5mL含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，洗下霉菌孢子，吸取菌液至無菌試管中，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制備成每1mL含菌數(shù)為50～100cfu/mL的菌懸液，備用。

2.2 供試液的制備方法 取樣品10g，加PH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液稀釋至100mL，制備成溶解均勻的1:10的供試液。

2.3 回收率試驗(yàn)

試驗(yàn)組 取規(guī)定量的供試液和50～100cfu各試驗(yàn)菌株分別注入同一平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度，平行制備2個(gè)平皿。細(xì)菌培養(yǎng)24～48h，白色念珠球菌和黑曲霉培養(yǎng)48～72h。

菌液組 取50～100cfu各試驗(yàn)菌株注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度，細(xì)菌培養(yǎng)24～48h，白色念珠球菌和黑曲霉培養(yǎng)48～72h，平行制備2個(gè)平皿。測(cè)定所加入的菌數(shù)。

供試品對(duì)照組:取規(guī)定量供試液，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度，細(xì)菌培養(yǎng)24－48 h，白色念珠球菌和黑曲霉培養(yǎng)48－72h。測(cè)定供試品本底菌數(shù)。

2.4 回收率的計(jì)算

2.4.1 常規(guī)法 取供試液1ml注皿，結(jié)果見表1。

表1 抗纖軟肝膠囊常規(guī)法試驗(yàn)結(jié)果(cfu/皿)

表1表明，常規(guī)法對(duì)大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率試驗(yàn)均高于70%，可采用常規(guī)法對(duì)抗纖軟肝膠囊霉菌及酵母菌數(shù)計(jì)數(shù)?？莶菅堪麠U菌、金黃色葡萄球菌的回收率均低于70%，表明采用常規(guī)法對(duì)抗纖軟肝膠囊進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)不可行。

2.4.2 培養(yǎng)基稀釋法 取供試液1ml注入2個(gè)平皿中(0.5ml/皿)，結(jié)果見表2。

表2 培養(yǎng)基稀釋法 (cfu/皿)

表2表明，采用培養(yǎng)基稀釋法 (0.5mL/皿)，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的回收率達(dá)到70%以上，故可采用該法進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。

2.5 細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)測(cè)定方法驗(yàn)證。

驗(yàn)證結(jié)果見表3。

表3 3批抗纖軟肝膠囊回收率試驗(yàn)結(jié)果 (%)

表3表明，采用培養(yǎng)基稀釋法 (0.5mL/皿)，進(jìn)行細(xì)菌微生物限度檢驗(yàn)，3種試驗(yàn)菌回收率均大于70%。霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法為常規(guī)法，其2種規(guī)定試驗(yàn)菌回收率均大于70%。方法可行。

3 控制菌檢驗(yàn)方法的建立及驗(yàn)證

試驗(yàn)組 取1:10供試液10mL接種至100mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基，同時(shí)加入大腸埃希菌10～100CFU，35℃培養(yǎng)24～48h。取培養(yǎng)物0.2mL接種至含5mLMUG培養(yǎng)基的試管中，35℃培養(yǎng)24h，360nm紫外燈下觀察熒光，然后進(jìn)行靛基質(zhì)試驗(yàn)，觀察結(jié)果;另取培養(yǎng)物劃線接種于曙紅亞甲藍(lán)(EMB)平板，35℃培養(yǎng)18～24h，觀察其菌落形態(tài)。

陰性菌對(duì)照組 取金黃色葡萄球菌作為陰性對(duì)照試驗(yàn)菌，方法同試驗(yàn)組。

經(jīng)膽鹽乳糖培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)后，試驗(yàn)組與陰性對(duì)照組相比較有明顯的變化，試驗(yàn)組有明顯產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn)象，結(jié)果見表4。

表4 大腸埃希菌檢查常規(guī)法試驗(yàn)結(jié)果

表4表明，采用常規(guī)法進(jìn)行大腸埃希菌檢驗(yàn)，方法成立。

4 3批抗纖軟肝膠囊的微生物限度檢查

按上述所建立的抗纖軟肝膠囊微生物限度檢查法，對(duì)3批樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)均小于10個(gè)/g，未檢出大腸埃希菌。

5 討論

5.1 《中國(guó)藥典》要求，建立產(chǎn)品的微生物限度檢查法，應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌、霉菌、及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證。抗纖軟肝膠囊是由多味中藥組成的復(fù)方中藥制劑，成分較為復(fù)雜，其中海藻、丹參、當(dāng)歸尾等具有抑菌作用，這些均可影響微生物限度檢查的準(zhǔn)確性，所以必須要建立抗纖軟肝膠囊的微生物限度檢查方法并加以驗(yàn)證。

5.2 經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究，采用常規(guī)法大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率試驗(yàn)均高于70%，枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌采用培養(yǎng)基稀釋法 (0.5 m1/皿)的回收率達(dá)到70%以上，控制菌采用常規(guī)法進(jìn)行檢驗(yàn)，可檢出大腸埃希菌。故抗纖軟肝膠囊微生物限度檢查法可采用常規(guī)法檢查霉菌、酵母菌和控制菌;培養(yǎng)基稀釋法檢查細(xì)菌。這為抗纖軟肝膠囊的微生物限度檢查法提供了科學(xué)依據(jù)。

［1］宋立人，丁緒亮等．現(xiàn)代中藥學(xué)大辭典 (下) ［M］，第1版．北京:人民衛(wèi)生出版社，2001:1791．

［2］宋立人，丁緒亮等．現(xiàn)代中藥學(xué)大辭典 (上) ［M］，第1版．北京:人民衛(wèi)生出版社，2001:443，823．

［3］田昭翠．鄭氏骨傷藥酒微生物限度檢查法驗(yàn)證［J］．云南中醫(yī)中藥雜志，2011，32(2):64～65．

［4］孫乃霞．治傷消瘀丸微生物限度檢查法的驗(yàn)證［J］．光明中醫(yī)，2011，26(2):226～228．

［5］中國(guó)藥典一部［S］．北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄XIllC:79～88．