高效液相色譜法測定緩釋微球中酮康唑的含量

張艷紅，孫麗建，李 強，趙冬梅，王清文

（1.東北林業(yè)大學 生物質材料科學與技術教育部重點實驗室，哈爾濱 150040；2.黑龍江大學 化學化工與材料學院，哈爾濱 150080；3.黑龍江東方學院 食品與環(huán)境工程學部，哈爾濱 150086）

酮康唑（Ketoconazole）是一種咪唑類廣譜抗真菌藥，通過抑制霉菌細胞膜中麥角甾醇的生物合成達到抗真菌的作用[1]。隨著近年來真菌病的發(fā)病率迅猛增長，越來越多的科研機構致力于酮康唑的研究及開發(fā)[2]。目前，國內外文獻中測定酮康唑所采用的HPLC法多用于粉劑、片劑、霜劑以及生物體液中酮康唑的檢測，但對于載藥微球緩慢釋放溶出液中酮康唑的含量測定，尚未見報道。本文建立了一種適用于測定微球中酮康唑含量的高效液相色譜（HPLC）測定法。

1 儀器與試劑

島津LC-10AT高效液相色譜儀，配有SPD-10A型檢測器。甲醇（色譜純），三乙胺（分析純），磷酸（優(yōu)級純），水（雙蒸餾水），酮康唑對照品（湖北恒碩化工有限公司），酮康唑緩釋微球（實驗室自制）。

2 方法與結果

2.1 酮康唑緩釋微球的制備

將乳酸－羥基乙酸共聚物（PLGA）溶于混合溶劑（苯／1，2-二氯乙烷＝17／10）中，再加入酮康唑，使其溶解成作為分散相的均一透明溶液，采用微流控裝置，將分散相滴入8%聚乙烯醇水溶液中制備載藥微球。將分離干燥后的微球裝入密封袋中保存。圖1是放大40倍的顯微鏡下觀察到的不同分散相流速下的PLGA載藥微球的照片，通過調整微流控裝置中分散相的流速即可得到不同粒徑的微球。圖2是在放大40倍的顯微鏡下觀察到的微球照片，所得微球表面光滑，粒徑較均一。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取一定量微球樣品置于燒杯中，加入一定量的苯使微球溶解，將溶解后的溶液置于分液漏斗中，加入一定量的甲醇溶液萃取，連續(xù)萃取3次，合并萃取液并定容，即得供試品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱為 ODS C18（250mm×4.6mm，5μm，迪馬公司），流動相為甲醇：磷酸緩沖鹽＝80／20（磷酸緩沖鹽：0.34mL磷酸與200mL雙蒸餾水混合，用三乙胺調節(jié)pH＝3.0），檢測波長為242nm，流量為0.80mL／min，柱溫為室溫，進樣量為20μL。

2.4 標準曲線的繪制

精密稱取一定量80℃減壓干燥至恒重的酮康唑對照品，用流動相配制成濃度分別為1.0、2.5、5.0、10、15、20、30μg／mL的對照品溶液，各進樣20μL，按上述色譜條件測定峰面積。以酮康唑濃度（C）對峰面積（A）進行線性回歸，得回歸方程為Y＝27298 X＋159.39（r＝0.9999）。該結果表明酮康唑在1.0～30.0μg／mL線性關系良好。

最低檢出限確定：取不同濃度的對照品溶液進行色譜分析，當主峰峰高為噪音峰高3倍時的濃度即為儀器的最低檢出限，酮康唑的最低檢出限為10.8ng／mL。

2.5 專屬性試驗[1]

在2.3色譜條件下，分別對供試樣溶液、對照品溶液和陰性對照品溶液（不含酮康唑的微球處理液）進行色譜分析，色譜圖見圖3。可見供試品與對照品溶液的色譜圖分別在保留時間（tR）5.89 min和5.63min處出現(xiàn)單一酮康唑吸收峰，陰性對照品溶液色譜圖在tR＝5.89min附近沒出現(xiàn)任何吸收峰，表明專屬性好。理論塔板數(shù)按酮康唑峰計算應≥2000。

圖3 色譜圖Fig.3 Chromatograms

2.6 精密度試驗（重復性）

取6份同一批次制備的緩釋微球，按2.2方法將藥物萃取并定容，制成濃度約為2.50μg／mL的對照品溶液，進行色譜分析，計算實際測得的濃度，結果見表1。

表1 精密度試驗（重復性）結果Table1 Precision experiment（repeatability）

2.7 回收率試驗

取3份空白微球置于燒杯中，分別精密加入一定量的酮康唑，按2.2方法進行萃取、定容、進行色譜分析，計算回收率，結果見表2。

表2 回收率試驗（n＝3）Table2 Recovery rate test（n＝3）

2.8 微球樣品中酮康唑含量的測定

按2.2方法制備供試品溶液，按2.3中的色譜條件進樣20μL，記錄色譜圖，按照工作曲線法計算樣品中酮康唑含量。載藥量為20%的PLGA微球中酮康唑的釋放曲線見圖4。

圖4 載藥量為20%的PLGA微球的釋藥曲線Fig.4 Release profile of 20%drug-loaded PLGA microspheres

3 結 論

藥典中HPLC法測定酮康唑制劑含量的流動相為0.2%的二異丙胺的甲醇溶液和0.5%的醋酸銨溶液（77／23）[3]。但在實際測定時，出峰時間較長約7 min，且峰形不好。其他文獻中流動相多為70%～90% 甲醇[4－6]。本文采用甲醇／緩沖鹽（80／20）時，由于加入三乙胺掃尾劑，可以改善色譜峰形，得到的是較為尖銳、對稱的峰形。該方法保留時間僅為5.89min，因此該方法優(yōu)于藥典中的方法。

實驗表明，HPLC法分離效率高、速度快，流動相可選擇范圍寬、靈敏度高、色譜柱可反復使用，適用于酮康唑微球中酮康唑含量的測定。

[1]徐蘭琴，黃 雁.高效液相色譜法直接測定酮康唑含量[J].廣州醫(yī)學院學報，1997，25（4）：84-86.

[2]杜繼紅，王婭芳，周艷飛，等.高效液相色譜法測定復方酮康唑溶液中酮康唑的含量 [J].中國動物保健，2009，（1）：103-104.

[3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[M].北京：化學工業(yè)出版社，2010：1066.

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