MMP－9及其抑制劑TIMP－2在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)與病理特征的相關(guān)性

鄭先杰，孫明飛，張雙林＊，宋言崢，張?bào)銚P(yáng)

（1.河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院 胸心血管外科，河南 開(kāi)封 475000；2，復(fù)旦大學(xué)附屬公共衛(wèi)生臨床中心，上海 200540）

肺癌轉(zhuǎn)移的發(fā)生需要腫瘤細(xì)胞能突破細(xì)胞處基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）及毛細(xì)血管基底膜，向周圍組織侵襲或進(jìn)入血循環(huán)及淋巴系統(tǒng)，逃逸機(jī)體免疫監(jiān)視系統(tǒng)，在遠(yuǎn)處組織或器官內(nèi)著床，形成轉(zhuǎn)移灶。其中基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是參與這一過(guò)程中最重要的蛋白酶。已有文獻(xiàn)報(bào)道［1］，惡性腫瘤中MMPs或TIMPs的表達(dá)與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、分期、分型、生存率的關(guān)系。我們采用免疫組化方法檢測(cè)了96例非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本及12例肺良性病變標(biāo)本中 MMP－9、TIMP－2的表達(dá)情況，旨在探討其與肺癌病理生理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

研究對(duì)象來(lái)自河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科2004年6月至2011年6月接受根治性手術(shù)治療的非小細(xì)胞肺癌患者96例，男性62例，女性34例，年齡39～82歲，平均（59.86±8.28）歲。另取同期手術(shù)的肺良性病變組織12例作對(duì)照，其中男性7例，女性5例，年齡16～72歲，平均（46.32±13.46）歲；支氣管擴(kuò)張3例，肺結(jié)核瘤5例，炎性假瘤3例，肺隔離癥1例。所有肺癌和良性病變標(biāo)本均以體積分?jǐn)?shù)為10%甲醛固定，石蠟包埋，經(jīng)HE染色病理確診。

1.2 主要試劑

TIMP－2、MMP－9兔抗人多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德（BOSTER）公司；生物素化羊抗兔抗體（二抗），以及過(guò)氧化物酶－鏈親和素復(fù)合物購(gòu)自北京中山公司。

1.3 免疫組化實(shí)驗(yàn)過(guò)程及操作方法

采用酶－鏈親程素標(biāo)記法（labelledsteptavidinbiotin method，LSAB法）。將5μm厚的石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。先經(jīng)3%過(guò)氧化氫（H2O2）阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化酶20min，MMP－9采用微波抗原修復(fù)，TIMP－2采用高壓抗原修復(fù)，然后依次加入正常羊血清（1∶20），一抗（TIMP－21∶100，MMP－91∶50），二抗（1∶200）；三抗（1∶200），分別于37℃恒溫箱孵育20、60、30min，PBS沖洗（除羊血清）。最后DABH2O2顯色，蘇木素復(fù)染，加拿大膠封片備查。陽(yáng)性對(duì)照采用北京中山公司提供的已知陽(yáng)性的乳腺癌組織，采用PBS代替一抗設(shè)立陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果評(píng)定

MMP－9和TIMP－2染色的判定是以細(xì)胞膜和細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。每張切片在400倍鏡下觀察5～10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100～200個(gè)支氣管黏膜上皮細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞，共計(jì)1000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算出每張切片的陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)作為評(píng)價(jià)各觀察指標(biāo)在該切片上的表達(dá)水平。染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜20%為－，20%～50%為＋，50%～70%為＋＋，＞70%為＋＋＋。所有計(jì)量數(shù)據(jù)均由兩名病理醫(yī)生采用雙盲法（獨(dú)立檢測(cè)）進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。采取P＜0.05為有顯著差異，P＜0.01為有非常顯著差異。

2 結(jié)果

MMP－9、TIMP－2在鱗癌、腺癌和癌旁肺組織中均有不同程度的表達(dá)。MMP－9和TIMP－2在肺腺癌中的表達(dá)最強(qiáng)，在鱗癌中的表達(dá)次之，在癌周肺組織中的表達(dá)最弱。MMP－9和TIMP－2在不同分化程度的肺癌組織中的表達(dá)無(wú)顯著性差異，MMP－9和TIMP－2在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織中的表達(dá)較強(qiáng)，與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組比較差異有顯著性，見(jiàn)表1、表2。

表1 MMP－9和TIMP－2在肺癌和癌旁組織中的表達(dá)

表2 MMP－9，TIMP－2在不同臨床特征肺癌組織中的表達(dá)

3 討論

基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）結(jié)合于活性MMPs的催化部位，下調(diào) MMPs的活性，抑制MMPs對(duì)ECM的降解，MMPs具有精確的調(diào)控機(jī)制，保證了體內(nèi)生理狀態(tài)下ECM的重建與穩(wěn)定，如果調(diào)節(jié)失控，MMPs或TIMPs平衡破壞，則可引發(fā)各種病理過(guò)程［1-2］。其中 TIMP－2是 MMP－9的特異性抑制劑，可以通過(guò)下調(diào)MMP－9的活性來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移［3］。正常組織中 MMPs和TIMPs之間存在微妙的平衡關(guān)系，維持ECM的穩(wěn)定。癌變時(shí)，MMPs和TIMPs的表達(dá)上調(diào)，但是TIMPs的增高程度不足以抑制MMPs活性，二者之間的平衡被打破，導(dǎo)致ECM過(guò)度降解［4］。腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤治療的難題，也是影響患者生存的主要原因。文獻(xiàn)證實(shí)［5］，腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞基質(zhì)成分共同參與有關(guān)。腫瘤細(xì)胞要發(fā)生轉(zhuǎn)移必須首先通過(guò)ECM及血管基底膜（basalmembrane，BM）構(gòu)成的一道天然屏障，在此過(guò)程中MMPs發(fā)揮了重要作用，MMP－9是MMPs中分子量最大的酶。MMP－9在腫瘤發(fā)展中的主要作用是降解ECM使得MMPs活性上調(diào)及促進(jìn)新生血管形成，增加腫瘤細(xì)胞的分泌，從而促進(jìn)腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移［6］。我們研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)肺癌組織及癌周組織中 MMP－9和 TIMP－2的表達(dá)，結(jié)果顯示，MMP－9，TIMP－2在鱗癌、腺癌、癌旁肺組織和良性肺組織中均有不同程度的表達(dá)。MMP－9和TIMP－2在腺癌中的表達(dá)較鱗癌強(qiáng)，在肺癌組織中的表達(dá)較癌周肺組織強(qiáng)。腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移發(fā)生較早，預(yù)后較差與MMP－9的高表達(dá)有關(guān)。MMP－9高表達(dá)使得腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)基底膜，發(fā)生侵襲的機(jī)會(huì)高；MMP－9對(duì)ECM和BM的降解作用使腫瘤細(xì)胞更容易從原發(fā)病灶脫落而到達(dá)遠(yuǎn)處淋巴結(jié)形成轉(zhuǎn)移灶。MMP－9和TIMP－2在不同分化程度的NSCLC組織中的表達(dá)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明MMP－9可能不是腫瘤發(fā)生的啟動(dòng)因子，只是作用于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移階段。

大量隨訪資料［7-9］還表明，肺癌患者的 MMP－9表達(dá)與其預(yù)后密切相關(guān)，MMP－9陽(yáng)性表達(dá)率高者，其預(yù)后較差。

李紅梅等［5］的研究顯示，轉(zhuǎn)移能力相對(duì)較高的細(xì)胞系產(chǎn)生MMPs的能力強(qiáng)于轉(zhuǎn)移能力相對(duì)較低的細(xì)胞系。MMP－9通過(guò)對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜中Ⅳ型膠原的特異性降解，使腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)能力增強(qiáng)，發(fā)生轉(zhuǎn)移的可能性增加。TIMP－2通過(guò)與 MMP－9以1∶1的比例特異性結(jié)合，抑制 MMP－9活性的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的能力下降。我們研究顯示，MMP－9和TIMP－2在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC組織中的表達(dá)較強(qiáng)，TIMP－2在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織中的增強(qiáng)程度明顯弱于 MMP－9的增強(qiáng)程度。說(shuō)明MMP－9與NSCLC的侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，MMP－9能夠促進(jìn) NSCLC的侵襲和轉(zhuǎn)移。TIMP－2作為MMP－9的特異性組織抑制物能夠抑制這種侵襲和轉(zhuǎn)移，在發(fā)生轉(zhuǎn)移的 NSCLC中 MMP－9／TIMP－2比值失衡，TIMP－2不足以抑制MMP－9的高度表達(dá)，從而發(fā)生 NSCLC的侵襲和轉(zhuǎn)移［6］。綜上所述，MMP－9及其特異性抑制因子TIMP－2在肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。應(yīng)用人工合成的TIMPs制劑抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移有望成為一個(gè)新的治療方向。

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