巴洛沙星–Tb3+–ATP熒光體系的建立及其分析應(yīng)用

富波，陳傳燕，王磊

（1.山東大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南 250012； 2.山東省高唐縣教育局，山東聊城 252000）

巴洛沙星–Tb3+–ATP熒光體系的建立及其分析應(yīng)用

富波1，陳傳燕2，王磊1

（1.山東大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南 250012； 2.山東省高唐縣教育局，山東聊城 252000）

在二元配合物巴洛沙星–Tb3+中加入ATP，Tb3+在其特征波長545 nm處的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，據(jù)此建立了新的巴洛沙星–Tb3+–ATP熒光體系。在最優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，增強(qiáng)的熒光強(qiáng)度與ATP的濃度呈良好的線性關(guān)系，線性范圍為2.0×10–6～3.0×10–5mol/L，檢出限為8.0×10–7mol/L。詳細(xì)的機(jī)理研究表明，ATP能與巴洛沙星–Tb3+形成大的三元絡(luò)合物熒光體系。新建立的熒光體系成功地應(yīng)用于ATP注射液中ATP的定量檢測。對不同批次ATP注射液進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，回收率為101%～106%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%～1.9%（n=5）。

ATP檢測；巴洛沙星；稀土鋱離子；喹諾酮類藥物

三磷酸腺苷二鈉（ATP）是三磷酸腺苷的二鈉鹽，分子式為C10H14N5Na2O13P3·3H2O，相對分子質(zhì)量為605.19，化學(xué)名稱為腺嘌呤核苷-5'-三磷酸酯二鈉鹽三水合物。

作為一種輔酶，ATP參與機(jī)體內(nèi)脂肪、蛋白質(zhì)、糖、核酸以及核苷酸的代謝，同時(shí)ATP又是體內(nèi)能量的主要來源，當(dāng)機(jī)體吸收、分泌、肌肉收縮及進(jìn)行生化合成反應(yīng)等需要能量時(shí)，三磷酸腺苷即分解成二磷酸腺苷及磷酸基，同時(shí)釋放出能量。動(dòng)物試驗(yàn)證明，ATP可抑制慢反應(yīng)纖維的慢鈣離子內(nèi)流，阻滯或延緩房室結(jié)折返途徑中的前向傳導(dǎo)，大劑量時(shí)還可能阻斷或延緩旁路的前向和逆向傳導(dǎo)；另外ATP還具有短暫強(qiáng)的增強(qiáng)迷走神經(jīng)的作用，因而能夠治療房室結(jié)折返和旁路折返機(jī)制引起的心律失常。

目前檢測ATP的方法主要有高效液相色譜方法［1，2］，生物發(fā)光法［3–6］和熒光分析法［7–10］。高效液相色譜方法準(zhǔn)確度高，但是操作復(fù)雜而且靈敏度不高；生物發(fā)光法靈敏度較高，但是一般有復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)，不容易控制；相比之下，熒光分析法不僅操作簡便，而且通常靈敏度較高，適用于常規(guī)分析測試。

目前已經(jīng)建立的測定ATP的熒光分析法主要有銪–四環(huán)素類–ATP［7］和鋱–喹喏酮類–ATP［8，9］熒光探針法和共振光散射方法［10］。

巴洛沙星是第4代喹諾酮類抗菌藥，與其它喹諾酮類一樣，能夠與稀土鋱離子形成二元配合物，當(dāng)將ATP加入到該二元體系中時(shí)，Tb3+在其特征波長545 nm處有明顯的熒光增強(qiáng)現(xiàn)象，并且增強(qiáng)的熒光強(qiáng)度與所加入的ATP的量之間呈良好的線性關(guān)系，據(jù)此建立了一種新的稀土發(fā)光方法來檢測ATP。該方法快速、簡單，而且線性范圍較寬，已經(jīng)成功地用于ATP注射液樣品中ATP含量的檢測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

熒光分光光度計(jì)：F–4500型，日本日立公司；

紫外分光光度計(jì)：UV–2550型，日本島津公司；

酸度計(jì)：PHS–3C型，上海雷磁儀器廠；

熒光分光光度計(jì)：LS–55型，美國珀金–埃爾默公司；

巴洛沙星（BLFX）對照品：99.0%，山東羅欣藥業(yè)股份有限公司；

BLFX儲備液：1.0×10–3mol/L，精密稱取已干燥至恒重的巴洛沙星對照品0.038 9 g，滴入適量0.1 mol/L氫氧化鈉溶液使其溶解，定容至100 mL；

鋱離子（Tb3+）儲備液：1.0×10–2mol/L，精密稱取七氧化四鋱（Tb4O7，光譜純，進(jìn)口分裝）0.187 1 g，滴加6 mol/L HCl適量，小心加熱使其溶解，待蒸發(fā)至近干，加水溶解并稀釋至100 mL，使用時(shí)逐級稀釋至刻度；

三磷酸腺苷二鈉（ATP）貯備液：1.0×10–2mol/L，精密稱取三磷酸腺苷二鈉(98%)0.061 7 g，加水溶解并稀釋至100 mL，使用時(shí)逐級稀釋至刻度；

Tris-HCl緩沖液：0.1 mol/L，精密稱取Tris 3.035 g，加水溶解并稀釋至250 mL，用6 mol/L HCl調(diào)節(jié)至pH 7.1；

NH4Cl–NH3緩沖液：0.1 mol/L，精密稱取NH4Cl 0.54 g，加水溶解并稀釋至100 mL，用NH3·H2O調(diào)節(jié)至pH 7.1；

NaAc–HAc緩沖液：0.1 mol/L，精密稱取NH4Cl 0.82 g，加水溶解并稀釋至100 mL，用HAc調(diào)節(jié)至pH 7.1；

NH4Ac–NH3緩沖液：0.1 mol/L，精密稱取NH4Cl 0.77 g，加水溶解并稀釋至100 mL，用NH3·H2O調(diào)節(jié)至pH 7.1；

所用試劑除標(biāo)明含量外均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水，儲備液置于4℃的冰箱中保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

于10 mL比色管中依次加入0.5 mL 0.1 mol/L Tris–HCl標(biāo)準(zhǔn)緩沖液，0.3 mL 1.0×10–4mol/L BLFX溶液，1.0 mL 1.0×10–3mol/L Tb3+溶液和不同體積1.0×10–4mol/L的ATP標(biāo)準(zhǔn)工作液，然后加蒸餾水稀釋并定容，振蕩搖勻，室溫下穩(wěn)定10 min后測其熒光光譜和吸收光譜，用1.0 cm熒光池，分別在λex=296 nm，λem=545 nm的條件下測定熒光強(qiáng)度，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為10 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 激發(fā)光譜和發(fā)射光譜

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，測定了該體系的激發(fā)和發(fā)射光譜，得到BLFX，ATP，BLFX–Tb3+，BLFX–ATP，Tb3+–ATP，BLFX–Tb3+–ATP的激發(fā)（1～6）和發(fā)射光譜（1’～6’）如圖1所示，IL代表熒光強(qiáng)度。

圖1 激發(fā)和發(fā)射光譜

從圖1中可以看出，單純的一元體系BLFX和BLFX–ATP二元體系的激發(fā)光譜相似，均在288 nm和334 nm處有一定的激發(fā)；一元體系A(chǔ)TP、二元體系BLFX–Tb3+和Tb3+–ATP沒有較明顯的激發(fā)峰，而三元體系BLFX–Tb3+–ATP分別在波長296 nm和335 nm有兩個(gè)明顯的激發(fā)峰。單純的BLFX在約450 nm處有一個(gè)很強(qiáng)的發(fā)射峰（圖中未完全顯示），BLFX–ATP也在約450 nm處有一個(gè)很強(qiáng)的發(fā)射峰，說明450 nm為BLFX的特征發(fā)射峰。BLFX–Tb3+二元體系在BLFX特征峰450 nm處的熒光明顯減弱，然而在Tb3+的特征發(fā)光波長545 nm處仍無明顯發(fā)光，當(dāng)加入ATP于此二元體系形成BLFX–Tb3+–ATP三元體系時(shí)，發(fā)現(xiàn)在鋱離子的特征發(fā)射波長489 nm和545 nm較強(qiáng)的熒光發(fā)射峰，證明三元體系的形成有利于配體之間的能量轉(zhuǎn)移，使熒光量子產(chǎn)率大大提高。

分別以波長296 nm和335 nm為激發(fā)波長，測定了其發(fā)射光譜，結(jié)果表明當(dāng)激發(fā)波長為296 nm時(shí)，三元體系BLFX–Tb3+–ATP在鋱離子的特征發(fā)射波長為489 nm和545 nm時(shí)有較強(qiáng)的熒光發(fā)射峰，當(dāng)激發(fā)波長為335 nm時(shí)，三元體系BLFX–Tb3+–ATP在鋱離子的特征發(fā)射波長489，545，583 nm處均有較強(qiáng)的熒光發(fā)射峰。在鋱離子的特征發(fā)光波長545 nm處的強(qiáng)度以296 nm為激發(fā)波長時(shí)較強(qiáng)，因此選擇λex=296 nm，λem=545 nm進(jìn)行進(jìn)一步研究測定。

實(shí)驗(yàn)條件：BLFX，3.0×10–6mol/L；Tb3+，1.0×10–4mol/L；ATP，3.0×10–5mol/L；Tris-HCl，5.0×10–3mol/L，pH 7.1。

2.2 pH值和緩沖溶液的影響

實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了pH值的變化對體系熒光強(qiáng)度增強(qiáng)ΔIL（ΔIL=I–I0）的影響，其中I為BLFX–Tb3+–ATP的熒光強(qiáng)度，I0為BLFX–Tb3+體系即不加待測ATP的空白的熒光強(qiáng)度。同樣，以下其它條件均指對ΔIL的影響。pH值的影響如圖2所示，由圖2可知，當(dāng)pH 7.1時(shí)，熒光強(qiáng)度ΔIL達(dá)到最大。同時(shí)實(shí)驗(yàn)了pH 7.1的不同緩沖液的影響，包括Tris-HCl，NH4Cl–NH3，NaAc–HAc和NH4Ac–NH3等，結(jié)果如表1所示，發(fā)現(xiàn)Tris-HCl緩沖液的緩沖效果最好，實(shí)驗(yàn)中選擇用0.5 mL 0.1 mol/L Tris–HCl緩沖液進(jìn)行進(jìn)一步研究。

圖2 pH的影響

表1 不同緩沖溶液對體系熒光強(qiáng)度的影響

2.3 巴洛沙星濃度的影響

在其它物質(zhì)濃度均為最佳條件下，實(shí)驗(yàn)了不同濃度的巴洛沙星（1.0×10–6～7.5×10–6mol/L）對體系熒光強(qiáng)度的影響，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)巴洛沙星的濃度在2.5×10–6～3.5×10–6mol/L范圍時(shí)體系的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)達(dá)到最大，因此實(shí)驗(yàn)中選擇最佳濃度3.0×10–6mol/L進(jìn)行研究。

2.4 鋱離子濃度的影響

使體系中其它物質(zhì)濃度都在最佳條件下且保持固定，實(shí)驗(yàn)了不同濃度鋱離子對該體系的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)鋱離子濃度為1.0×10–4mol/L時(shí)，體系的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)達(dá)到最大且保持恒定，于是選擇1.0×10–4mol/L為最佳濃度進(jìn)行研究。

2.5 試劑的加入順序和信號穩(wěn)定性

在所有物質(zhì)濃度均為最佳條件下，實(shí)驗(yàn)了不同加樣順序?qū)w系熒光強(qiáng)度的影響，結(jié)果如表2所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的加樣順序下體系的熒光強(qiáng)度差別不大，重復(fù)兩次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)加樣順序?yàn)锽LFX，Tb3+，ATP，Tris–HCl時(shí)熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。因此選擇此加樣順序進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)了不同穩(wěn)定時(shí)間對熒光強(qiáng)度的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)穩(wěn)定10 min時(shí)熒光強(qiáng)度即可達(dá)到最大，繼續(xù)增加穩(wěn)定時(shí)間熒光強(qiáng)度變化不大，信號強(qiáng)度在2 h內(nèi)保持不變。

表2 試劑加入順序的影響

2.6 干擾物質(zhì)的影響

固定ATP濃度為1.0×10–5mol/L，其它物質(zhì)濃度均在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，實(shí)驗(yàn)了一些共存物質(zhì)的影響，結(jié)果如表3所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對誤差在±10%以內(nèi)時(shí)，大多數(shù)氨基酸和金屬離子對體系熒光強(qiáng)度影響不大。

表3 共存干擾物質(zhì)的影響

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

在最優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，該體系的熒光強(qiáng)度ΔIL與ATP的濃度c呈良好的線性關(guān)系，線性范圍為2.0×10–6～3.0×10–5mol/L。線性方程為ΔIL=–161.4+9.391×107cATP，相關(guān)系數(shù)為0.998 1。在信噪比為3時(shí)，檢出限為8.0×10–7mol/L。

2.8 樣品分析

取市售ATP注射液針劑（江蘇康寶制藥有限公司，批號080753，080105，080454；天津藥業(yè)焦作有限公司，批號08072231），從針劑中精確量取1.0 mL于100 mL容量瓶中，加水稀釋并定容至刻度，得到濃度為1.65×10–4mol/L的儲備液，使用時(shí)將其稀釋到一定程度即得工作液。

在10 mL比色管中，依次加入0.3 mL 1.0×10–4mol/L BLFX溶液，1.0 mL的1.0×10–3mol/L Tb3+溶液和0.6 mL 1.65×10–4mol/L的ATP注射劑工作液，0.5 mL 0.1 mol/L Tris–HCl標(biāo)準(zhǔn)緩沖液，按照實(shí)驗(yàn)方法所述進(jìn)行測定，測定結(jié)果如表4所示。結(jié)果顯示該方法測得的含量與標(biāo)簽上的值在允許誤差范圍內(nèi)能較好地符合。

表4 ATP注射液測定結(jié)果(n=5)

2.9 機(jī)理探討

2.9.1 BLFX–Tb3+–ATP三元復(fù)合物的形成

BLFX，ATP，BLFX–Tb3+，BLFX–ATP，Tb3+–ATP和BLFX–Tb3+–ATP的吸收光譜如圖3所示。

圖3 紫外吸收光譜

從圖3中可以看出，單純的BLFX在波長286 nm有一較強(qiáng)的吸收峰，在334 nm處有一個(gè)較弱但較平穩(wěn)的吸收峰；BLFX–Tb3+與BLFX的吸收峰峰形相似，最大吸收波長略有紅移，分別在290 nm和336 nm處有兩個(gè)吸收鋒，且強(qiáng)度比BLFX有一定的增大，這說明BLFX和Tb3+存在相互作用，形成了配合物。單純的ATP僅在波長260 nm處有一個(gè)很強(qiáng)的吸收峰，在波長大于288 nm后無明顯吸收，說明ATP在260 nm處有特征吸收；BLFX–ATP除在259 nm處有一個(gè)很強(qiáng)的吸收峰，且強(qiáng)度大于單純的ATP外，在波長大于288 nm后約331 nm處有一較寬的吸收帶，但強(qiáng)度很弱；Tb3+–ATP在260 nm處有一個(gè)吸收峰，強(qiáng)度比單純的ATP稍低；三元體系BLFX–Tb3+–ATP不僅在ATP的特征吸收峰259 nm處有一吸收峰，而且在290 nm處出現(xiàn)了一肩峰，在334 nm處出現(xiàn)一較平穩(wěn)峰，證明三者之間相互作用，又生成了新的BLFX–Tb3+–ATP大分子三元復(fù)合物。

通過共振光散射光譜（RLS）進(jìn)行證明。按照實(shí)驗(yàn)最佳條件配制溶液并穩(wěn)定30 min后，用1.0 cm熒光池，通過同時(shí)掃描，使激發(fā)和發(fā)射波長相等，狹縫λex=10 nm/λem=10 nm，測定RLS光譜，共振光散射光譜如圖4所示。從圖4中可以看出，單純的一元體系BLFX的共振光散射很弱，單純的ATP的共振光散射較強(qiáng)，二元體系BLFX–Tb3+，BLFX–ATP，Tb3+–ATP的共振光散射強(qiáng)度沒有明顯增強(qiáng)，而三元體系BLFX–Tb3+–ATP的共振光散射有明顯的增強(qiáng)。證明了ATP與BLFX–Tb3+之間有強(qiáng)烈的相互作用，形成了一個(gè)大的超分子復(fù)合物。

圖4 共振光散射光譜

2.9.2 發(fā)光增強(qiáng)機(jī)制

喹喏酮類藥物BLFX是稀土鋱離子的良好配體，二者之間通過共振能量轉(zhuǎn)移，BLFX能將其能量轉(zhuǎn)移給稀土鋱離子，從而使鋱離子發(fā)出其特征熒光。加入ATP后，體系中發(fā)光明顯增強(qiáng)。通過以上實(shí)驗(yàn)可知，BLFX和Tb3+的最佳條件下濃度比值為1∶33.3，即在該體系中Tb3+大大過量，則Tb3+除了與BLFX形成配合物外，還會和周圍的水分子結(jié)合，這樣就會因?yàn)樗肿又蠴—H的震動(dòng)而引起非輻射能量損耗。而加入ATP后，ATP中的三磷酸根負(fù)離子會與過量的鋱離子結(jié)合，從而取代了鋱離子周圍的水分子，形成了大的三元復(fù)合物BLFX–Tb3+–ATP，既減少了因水分子的O—H的震動(dòng)而引起的非輻射能量損耗，又增加了體系的疏水性，所以體系中鋱離子的熒光明顯增強(qiáng)。

3 結(jié)論

在二元配合物BLFX–Tb3+中加入ATP，ATP能顯著增強(qiáng)該體系中鋱離子的特征發(fā)光，據(jù)此建立了一個(gè)新的BLFX–Tb3+–ATP熒光探針體系。詳細(xì)的機(jī)理研究表明ATP能與BLFX–Tb3+形成大的三元絡(luò)合物熒光體系。新建立的熒光探針體系成功地應(yīng)用于ATP注射液中ATP的定量檢測，為常規(guī)檢測ATP提供了一個(gè)簡便靈敏的方法。

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Establishment of Balo fl oxacin-Tb3+–ATP Fluorescence System and Its Analytical Application

Fu Bo1， Chen Chuanyan2， Wang Lei1
（1.School of Pharmacy， Shandong University， Jinan 250012， China；2.Gaotang Education Bureau， Shandong Province， Liaocheng 252000， China）

A new balo fl oxacin-Tb3+–ATP fl uorescence system was established. Adding ATP into the binary system of balo fl oxacin-Tb3+，the fl uorescence intensity of Tb3+increased in its characteristic wavelength of 545 nm. Under the optimal experimental conditions，the enhanced fl uorescence intensity was proportional to the concentration of ATP in the range of 2.0×10–6–3.0×10–5mol/L，the detection limit was 8.0×10–7mol/L. The detailed mechanistic studies showed that ATP could form a ternary complex with balo fl oxacin-Tb3+. This new fl uorescence system was successfully applied to the quantitative detection of ATP in injection. The recoveries of ATP injecta were 101%–106%, the RSD was 1.1%–1.9%(n=5).

ATP detection; balo fl oxacin; terbium ion; quinolones

O657.39

A

1008–6145(2012)03–0039–05

10.3969/j.issn.1008–6145.2012.03.011

聯(lián)系人：王磊；E-mail: wangl-sdu@sdu.edu.cn

2012–02–09