單、雙標(biāo)記基因篩選的轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白基因供核細(xì)胞生產(chǎn)克隆山羊效率的比較

安禮友，袁玉國(guó)，于寶利，楊廷佳，成勇

揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009

細(xì)胞核移植方法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物已被廣泛用于生產(chǎn)重組蛋白。目前通過(guò)轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物，表達(dá)的重組蛋白有人乳鐵蛋白[1]、人凝血因子Ⅸ[2]、人溶菌酶[3]、血紅蛋白生成素[4]、人血清白蛋白[5]等。但轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物的出生率還很低，轉(zhuǎn)基因克隆的成功率還受諸多因素制約，如：表達(dá)載體、供核細(xì)胞、卵母細(xì)胞、核移植程序、外源基因?qū)ε咛グl(fā)育的影響等[6]。

因?yàn)檗D(zhuǎn)基因細(xì)胞通過(guò)分泌保護(hù)性蛋白或細(xì)胞接觸保護(hù)非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，藥物篩選可能得到的是轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因的混合細(xì)胞。有報(bào)道，藥物篩選后的細(xì)胞用于體細(xì)胞核移植，新生的克隆動(dòng)物有部分是非轉(zhuǎn)基因的[5,7]。藥物篩選得到的細(xì)胞株中，如存在非轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞，利用PCR 方法無(wú)法檢測(cè)出非轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞。綠色熒光蛋白(GFP)作為可視化的分子標(biāo)記，已被用來(lái)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物，如牛[8]、山羊[9]、豬[10]、鼠[11]、兔[12]，GFP 在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)能指示出抗性細(xì)胞株中細(xì)胞株基因整合情況。

本研究分別利用單標(biāo)記基因(Neor)表達(dá)載體pBLC14和雙標(biāo)記基因(Neor/GFP)表達(dá)載體pAPLM 生產(chǎn)轉(zhuǎn)hLF 基因山羊，比較了其在供核細(xì)胞篩選上的特點(diǎn)，以及在體細(xì)胞核移植中對(duì)克隆效率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

Taq 酶、內(nèi)切酶、修飾酶購(gòu)自TaKaRa 公司；DMEM/F12、FBS 購(gòu)自Invitrogen 公司；G418購(gòu)自AMRISCO 公司；細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自NUNC 公司；其他試劑除特殊說(shuō)明外，均購(gòu)自Sigma 公司；實(shí)驗(yàn)用羊購(gòu)自揚(yáng)州地區(qū)。

1.2 轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體

單標(biāo)記基因(Neor)乳腺特異性表達(dá)載體pBLC14為本實(shí)驗(yàn)室保存(圖1)[13]，載體為β-乳球蛋白基因調(diào)控區(qū)指導(dǎo)的人乳鐵蛋白基因乳腺特異性表達(dá)載體，包括β-乳球蛋白基因調(diào)控序列(BLG)、巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)/增強(qiáng)子(CMV)、人乳鐵蛋白(hLF) cDNA 和新霉素抗性基因(Neor)。

雙標(biāo)記基因(Neor/GFP)乳腺特異性表達(dá)載體pAPLM 為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建(圖1)[14]，包括αs1酪蛋白基因調(diào)控序列(αs1-CN)、巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)/增強(qiáng)子(CMV)、人乳鐵蛋白(hLF) cDNA、新霉素抗性和綠色熒光蛋白雙標(biāo)記基因(Neor/GFP)。

pBLC14與pAPLM 分別以Sal Ⅰ+ NotⅠ雙酶切獲得真核表達(dá)片段，經(jīng)膠回收試劑盒(QIAquick Gel Extraction Kit，QIAGEN)回收片段，DNA溶于雙蒸超純水中并定量，用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

圖1 pBLC14和pAPLM 轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體Fig.1 pBLC14 and pAPLM transgenic expression vectors.

1.3 胎兒成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)

無(wú)菌手術(shù)獲取35日齡奶山羊胎兒，去除胎兒頭四肢及內(nèi)臟團(tuán)，剪碎胎兒組織，0.25%胰蛋白酶37℃消化10 min，消化懸液離心收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，然后用細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM/F12+10%FBS)懸浮細(xì)胞，密度到5×105個(gè)/mL；細(xì)胞接種到175 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)。

1.4 基因轉(zhuǎn)染胎兒成纖維細(xì)胞及G418篩選

P2代胎兒成纖維細(xì)胞長(zhǎng)至80%匯合時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染，0.05%胰酶+0.04% EDTA 消化回收細(xì)胞，離心后用低滲電轉(zhuǎn)染液(Hypoosmolar buffer，Eppendorf 公司)清洗細(xì)胞并計(jì)數(shù)細(xì)胞；用低滲電轉(zhuǎn)染液懸浮細(xì)胞至細(xì)胞密度至3×106個(gè)/mL，分別加入pBLC14與pAPLM 片段進(jìn)行電轉(zhuǎn)染，使DNA 濃度為20 mg/L，將混合液移入電極間隙為2 mm 的電轉(zhuǎn)染杯(Eppendorf 公司)，在270 V，100μs 條件下電擊1次(Multiporator,Eppendorf 公司)，室溫靜置8 min，細(xì)胞稀釋后接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)；12 h 后換新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液。

胎兒成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染pBLC14與pAPLM 基因后36 h，換抗性培養(yǎng)液(DMEM/F12+10%FBS+600 mg/L G418)培養(yǎng)；篩選8～10 d，對(duì)孔中生長(zhǎng)的單克隆細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，以300 mg/L G418維持，細(xì)胞擴(kuò)增到12孔板中生長(zhǎng)匯合時(shí)，部分用凍存液(DMEM/F12+20% FBS+10%DMSO)凍存細(xì)胞，部分?jǐn)U大培養(yǎng)用于外源基因整合檢測(cè)。

1.5 pAPLM 細(xì)胞的熒光觀察

轉(zhuǎn)染pAPLM 細(xì)胞篩選8 d 左右，對(duì)細(xì)胞克隆進(jìn)行細(xì)胞熒光觀察。D-Hank's 清洗細(xì)胞后換入新鮮培養(yǎng)液；在熒光倒置顯微鏡(OLMYPUS IX71)下觀察細(xì)胞熒光(λex：470～490 nm，λem：510～550 nm)；并對(duì)每個(gè)細(xì)胞克隆進(jìn)行細(xì)胞熒光率統(tǒng)計(jì)，細(xì)胞熒光率＝每視野熒光細(xì)胞數(shù)/每視野細(xì)胞數(shù)×100%；生長(zhǎng)能力好、有熒光的細(xì)胞株進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并進(jìn)行細(xì)胞熒光率統(tǒng)計(jì)。

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)基因檢測(cè)

轉(zhuǎn)染pBLC14與pAPLM 基因細(xì)胞克隆，在24孔培養(yǎng)板中長(zhǎng)至80%匯合時(shí)，消化收集細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞裂解后直接進(jìn)行PCR 轉(zhuǎn)基因整合檢測(cè)。每孔細(xì)胞(5000個(gè)細(xì)胞)使用50μL 細(xì)胞裂解液(40 mmol/L Tris-HCl，pH 8.9，0.9% Triton X-100，0.9% Nonidet P-40，0.4 g/L 蛋白酶K)45℃裂解1 h，8510 min

℃滅活蛋白酶K，取4μL 作為模板進(jìn)行PCR 反應(yīng)，檢測(cè)引物為CMV-LF 跨接頭引物CMV-LF 1/CMV-LF 2(表1)；PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.7 體細(xì)胞核移植及胚胎融合、激活

轉(zhuǎn)染pBLC14細(xì)胞，PCR 檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞株用作供核細(xì)胞；轉(zhuǎn)染pAPLM 細(xì)胞，所有細(xì)胞在傳代中有熒光的細(xì)胞株選作供核細(xì)胞。供核細(xì)胞經(jīng)血清饑餓(DMEM/F12+0.5% FBS)48 h 后用于細(xì)胞核移植。

在細(xì)胞核移植0.5 h 前，0.25%胰酶消化收集血清饑餓細(xì)胞，M2懸浮細(xì)胞使細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL；細(xì)胞懸液放入eppendorf 離心管中，37℃孵育待用。

供質(zhì)卵母細(xì)胞來(lái)自超排的長(zhǎng)江三角洲白山羊，注射LHRH 之后28 h，通過(guò)外科手術(shù)方法從供體母山羊輸卵管中回收，用透明質(zhì)酸酶消化去除顆粒細(xì)胞。

去核、移核、電融合及激活等細(xì)胞核移植方法參照文獻(xiàn)[15]。

1.8 胚胎移植及妊娠檢查

激活后的胚胎在激活后8～10 h，經(jīng)外科手術(shù)移植到同期自然發(fā)情的受體輸卵管中，每只受體移植8～14枚胚胎；胚胎移植后，分別在35、60 d進(jìn)行B 超診斷受體妊娠情況。

1.9 出生的克隆山羊PCR、Southern blotting外源基因整合檢測(cè)

剪取新生山羊耳尖皮膚，經(jīng)蛋白酶K 消化6 h 后，提取組織DNA。共使用3對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)外源基因整合，第1對(duì)引物L(fēng)F 1/LF 2擴(kuò)增人乳鐵蛋白基因；第2對(duì)引物NEO 1/NEO 2擴(kuò)增Neo 基因；第3對(duì)引物GFP 1/GFP 2擴(kuò)增GFP 基因(pAPLM 適用)。引物序列見(jiàn)表1。

新生山羊基因組DNA 用EcoR Ⅴ消化過(guò)夜，1%瓊脂糖凝膠分離消化后的基因組，DNA 轉(zhuǎn)移到正電尼龍膜上，Neor-dig 標(biāo)記探針雜交，NBT/BCIP 顯色(Roche，DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I)。

1.10 pAPLM 轉(zhuǎn)基因山羊體細(xì)胞熒光觀察

取新生山羊耳尖皮膚，用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)皮膚成纖維細(xì)胞，利用熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞熒光；皮膚細(xì)胞經(jīng)5-Aza-2’-deoxycytidine(2μmol/L)和Trichostain A (5μmol/L)處理，48 h 后去除藥物并觀察細(xì)胞熒光。

表1 PCR 檢測(cè)所用引物Table 1 Primers for PCR amplification

2 結(jié)果

2.1 pBLC14與pAPLM 供核細(xì)胞的準(zhǔn)備

表達(dá)載體pBLC14轉(zhuǎn)染胎兒成纖維細(xì)胞，G418篩選共得到細(xì)胞34株，20株細(xì)胞PCR 鑒定為陽(yáng)性(表2)，其中7株作為供核細(xì)胞。

表達(dá)載體pAPLM 轉(zhuǎn)染胎兒成纖維細(xì)胞，經(jīng)G418篩選共獲得抗性細(xì)胞30株，其中26株為PCR 鑒定陽(yáng)性；陽(yáng)性細(xì)胞株在熒光顯微鏡下觀察熒光，PCR 鑒定陰性的細(xì)胞株未觀察到熒光，PCR 鑒定陽(yáng)性的26細(xì)胞株中有23株可觀察到熒光，在觀察到熒光的23細(xì)胞株中，其中12株細(xì)胞的熒光檢出率為100%，即每個(gè)細(xì)胞均有熒光；這些細(xì)胞傳代后，有12、10、11株細(xì)胞分別在P7、P9、P11代觀察到每株細(xì)胞均有熒光，其中6株細(xì)胞在傳代過(guò)程中始終每個(gè)細(xì)胞均可見(jiàn)熒光(見(jiàn)表2和圖2)，該6株細(xì)胞作為供核細(xì)胞用于體細(xì)胞核移植。

2.2 pBLC14與pAPLM 克隆山羊的生產(chǎn)

共使用供體山羊136頭，獲得成熟卵母細(xì)胞1266枚，制作重構(gòu)胚1066枚，融合重構(gòu)卵806枚，770枚融合胚胎移植入72只受體山羊(表3)。

轉(zhuǎn)pBLC14基因細(xì)胞核移植，在胚胎移植后35 d、60 d 進(jìn)行B 超妊娠診斷，分別有14、7只受體妊娠；期間1只受體流產(chǎn)1只胎兒；最終3只妊娠到期，出生5只羔羊(表3)；4只羔羊分別在出生后1、7、50 d 死亡，1只存活至今。

圖2 pAPLM 轉(zhuǎn)染胎兒成纖維細(xì)胞熒光蛋白表達(dá)Fig.2 GFP expression in pAPLM transfected fibroblast cells.

轉(zhuǎn)pAPLM 基因細(xì)胞核移植，在胚胎移植后35、60 d 進(jìn)行B 超妊娠診斷，分別有18、10只受體妊娠；其中有2只受體未發(fā)育到期流產(chǎn)胎兒3只；最終6只受體羊妊娠到期，出生羔羊7只(表3)；3只羔羊分別在出生后7、30、90 d 因呼吸系統(tǒng)疾病死亡，4只存活至今。

2.3 出生的克隆山羊外源基因整合檢測(cè)

PCR 分析來(lái)自pBLC14轉(zhuǎn)基因供核細(xì)胞的克隆山羊基因組DNA，從所有出生的克隆山羊擴(kuò)增獲得435 bp (Neor)和475 bp (hLF)片段(圖3)，顯示流產(chǎn)胎兒及出生山羊基因組中整合有pBLC14基因，Southern blotting 結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)外源基因的存在(圖5)。

PCR 分析來(lái)自pAPLM 轉(zhuǎn)基因供核細(xì)胞的克隆山羊基因組DNA，分別擴(kuò)增獲得GFP (507 bp)，Neor(435 bp)和hLF (475 bp)基因片段(圖4)，Southern blotting 結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)出生山羊均含有pAPLM 外源基因(圖5)。

表2 轉(zhuǎn)pBLC14和pAPLM 基因細(xì)胞株篩選特性Table 2 Selection details of pBLC14 and pAPLM transgene-transfected cells

表3 轉(zhuǎn)pBLC14和pAPLM 基因克隆山羊的制作效率Table 3 Efficiency of nuclear transfer using pBLC14 and pAPLM transgenic donor cells

圖3 出生的克隆山羊pBLC14外源基因PCR 整合檢測(cè)Fig.3 PCR analysis of pBLC14 transgene integration in cloned goats.The amplified products were a 435 bp fragment of the Neor gene (A),and a 475 bp fragment of the hLF gene (B).1:positive control (pBLC14 transgene vector);2:negative control (recipient goat);3?7:cloned goats L1,BL-4-1,BL-4-2,BL-8-1,BL-8-2;M1:200-bp DNA ladder marker;M2:DL2000 DNA marker.

圖4 出生的克隆山羊pAPLM 外源基因PCR 整合檢測(cè)Fig.4 PCR analysis of pAPLM transgene integration in cloned goats.The amplified products were a 507 bp fragment of the GFP gene (A),a 435 bp fragment of the Neor gene (B),and a 475 bp fragment of the hLF gene(C).1:positive control (pAPLM transgene vector);2:negative control (recipient goat);3?9:cloned goats L2,L3,L4,L5,L6,BL-67,and BL-40;M1:200 bp DNA ladder marker;M2:DL2000 DNA marker.

圖5 存活的克隆山羊外源基因Southern blotting 整合檢測(cè)Fig.5 Southern blotting analysis of transgene integration in living cloned goats.1:pAPLM transgenic kid L1;2?5:pCNLF-ng transgenic kids L3,L4,L5,L6;6:negative control (recipient goat);7:positive control(pAPLM vector).

2.4 pAPLM 轉(zhuǎn)基因山羊細(xì)胞熒光觀察

取新生pAPLM 克隆山羊耳尖組織培養(yǎng)獲得皮膚成纖維細(xì)胞，熒光倒置顯微鏡觀察顯示細(xì)胞無(wú)熒光；細(xì)胞經(jīng)5-Aza-2’-deoxycytidine 和Trichostain A 處理，約有30%的細(xì)胞觀察到熒光(圖6)。

圖6 pAPLM 轉(zhuǎn)基因山羊細(xì)胞的熒光蛋白表達(dá)Fig.6 GFP expression in fibroblast cells of pAPLM cloned kids.Cells were treated with 5-Aza-2’-deoxycytidine and Trichostain A,observed under fluorescent microscopy with phase contrast filter (A) and FITC filter (B).

3 討論

在本研究中，應(yīng)用單標(biāo)記基因(Neor)和雙標(biāo)記基因(Neor/GFP)作為胎兒成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)基因篩選標(biāo)記。單標(biāo)記基因(Neor)經(jīng)G418篩選和PCR 檢測(cè)獲得整合外源基因的供核細(xì)胞；雙標(biāo)記基因(Neor/GFP)經(jīng)G418篩選、PCR 檢測(cè)和細(xì)胞熒光分析，獲得整合外源基因的細(xì)胞株。應(yīng)用單和雙標(biāo)記基因均成功地生產(chǎn)出轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白基因克隆山羊。

通過(guò)體細(xì)胞核移植技術(shù)來(lái)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，首先要獲得轉(zhuǎn)基因的供核細(xì)胞。利用G418藥物和PCR 篩選供核細(xì)胞，出生的克隆動(dòng)物并非全部整合有外源基因[5,7]，表明通過(guò)抗生素篩選和PCR 檢測(cè)獲得的細(xì)胞株轉(zhuǎn)基因供核細(xì)胞同時(shí)包含轉(zhuǎn)基因供核細(xì)胞和非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。我們的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一結(jié)果，Neor標(biāo)記基因載體pBLC14轉(zhuǎn)染獲得的抗性細(xì)胞株中，只有58.8%(20)的細(xì)胞株P(guān)CR 檢測(cè)到外源基因；相對(duì)來(lái)說(shuō)，在Neor/GFP 雙標(biāo)記載體pAPLM 轉(zhuǎn)染獲得的藥物抗性細(xì)胞株中，86.7%(26)細(xì)胞株P(guān)CR 檢測(cè)到外源基因，其中只有76.7%(23)細(xì)胞株能觀察到熒光，細(xì)胞經(jīng)傳代幾次后，僅有20%(6)細(xì)胞株中每個(gè)細(xì)胞均可見(jiàn)穩(wěn)定表達(dá)熒光。結(jié)果表明通過(guò)G418藥物篩選獲得的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株中存在少數(shù)非轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞株，另外的80%細(xì)胞株不見(jiàn)熒光或部分細(xì)胞可見(jiàn)熒光。這一現(xiàn)象可能原因有：一是在細(xì)胞單克隆化細(xì)胞株的操作時(shí)混入了非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，不管是使用克隆環(huán)挑取細(xì)胞克隆還是用細(xì)胞有限稀釋法克隆化細(xì)胞株，都不能保證擴(kuò)增的細(xì)胞株來(lái)源于單個(gè)細(xì)胞[16]，G418篩選的細(xì)胞具有“bystander”效應(yīng)，抗性細(xì)胞能保護(hù)鄰近非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞存活[7,17]；二是細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間的篩選培養(yǎng)部分細(xì)胞表觀遺傳信息的改變，造成部分細(xì)胞失去表達(dá)GFP 蛋白的能力[9]；三是表達(dá)的GFP 蛋白存在于培養(yǎng)液中，進(jìn)入非GFP 表達(dá)細(xì)胞內(nèi)，熒光觀察前的簡(jiǎn)要清洗不能完全去除，從而使細(xì)胞能觀察到熒光。而在我們的研究中，應(yīng)用Neor/GFP 雙標(biāo)記基因構(gòu)建載體pAPLM 轉(zhuǎn)染胎兒成纖維細(xì)胞，在抗性細(xì)胞株傳代過(guò)程中，利用GFP 蛋白的表達(dá)來(lái)鑒定細(xì)胞株中單個(gè)細(xì)胞的外源基因整合，每個(gè)細(xì)胞在傳代中能連續(xù)觀察到熒光的細(xì)胞株選作核供體細(xì)胞，最大限度排除上述三種情況，確保篩選得到的供核細(xì)胞是轉(zhuǎn)基因的。雖然通過(guò)降低抗性篩選時(shí)的細(xì)胞接種密度也可以增加獲得轉(zhuǎn)基因單細(xì)胞克隆的機(jī)率和減少偽轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，但是從根本上并不能保證單克隆化得到的細(xì)胞株是由一個(gè)轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞擴(kuò)增而來(lái)、排除非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞混入[16]；此外，這種方法增加了轉(zhuǎn)基因細(xì)胞克隆化的難度，需要相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間對(duì)細(xì)胞克隆進(jìn)行擴(kuò)增以滿足細(xì)胞核移植的需要，供核細(xì)胞在體外長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)會(huì)降低細(xì)胞核移植的效率[18]。

單和雙標(biāo)記基因篩選得到的供核細(xì)胞，均獲得出生的活山羊，經(jīng)檢測(cè)均整合有轉(zhuǎn)基因。表明應(yīng)用單和雙標(biāo)記基因，均能獲得轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物。但是，在之前的研究報(bào)道中，單篩選基因往往會(huì)得到非轉(zhuǎn)基因動(dòng)物[7,19]，表明出生非轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的風(fēng)險(xiǎn)依然存在。利用雙標(biāo)記基因，至今還沒(méi)有獲得非轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的報(bào)道。因此，雙標(biāo)記基因與單篩選基因相比，能提高轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)效率。

在體細(xì)胞核移植的過(guò)程中，比較了Neor與Neor/GFP 標(biāo)記基因?qū)χ谱骷?xì)胞核移植動(dòng)物效率的影響，包括重構(gòu)胚制作效率(融合率)、胚胎發(fā)育能力(受體懷孕率、克隆山羊出生率)。pBLC14、pAPLM 載體的重構(gòu)卵其融合率分別為76.6%和73.8%，35、60 d 檢查受體羊妊娠率分別為53.8%、26.9%和39.1%、21.7%，克隆山羊出生率(出生數(shù)/胚胎移植數(shù))分別為1.9%和1.4%；與pBLC14相比，pAPLM 載體表現(xiàn)出較低的重構(gòu)胚融合率、受體妊娠率和克隆山羊出生率，但差異不顯著(P＞0.05)。Neor與Neor/GFP標(biāo)記基因?qū)χ谱骷?xì)胞核移植動(dòng)物效率的影響的比較研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

制作體細(xì)胞核移植山羊，以胎兒成纖維細(xì)胞作為供核細(xì)胞，Keefer、Melicna 和Yuan 等取得相似的山羊出生率(0.5、0.9和2.2%)[9,20-21]，出生動(dòng)物也有近60%的死亡率，新生兒死亡的主要原因是肺部病灶。在我們的研究中出生率和死亡率分別為1.9%、80%(pBLC14)和1.4%、42.8%(pAPLM)，新生山羊的死亡與標(biāo)記基因沒(méi)有直接相關(guān)性。以上數(shù)據(jù)表明單(Neor)與雙(Neor/GFP)標(biāo)記基因?qū)ιa(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物效率沒(méi)有明顯差異。pBLC14和PAPLM 載體在構(gòu)建中，分別在Neor與Neor/GFP 標(biāo)記基因前后植入了loxP 位點(diǎn)(圖1)，可以在優(yōu)良性狀的克隆羊中，通過(guò)Cre 酶刪除標(biāo)記基因。

綜上所述，單、雙標(biāo)記基因均對(duì)克隆效率沒(méi)有影響，兩者之間克隆效率也沒(méi)有顯著差異；雙標(biāo)記基因的表達(dá)載體在供核細(xì)胞篩選的準(zhǔn)確性和可靠性方面有明顯優(yōu)勢(shì)。

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