瘦素對大鼠氣道平滑肌細胞凋亡的影響

倪文靜，朱述陽，劉文靜，吳 瑕，陳云峰，趙 玲

（徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院呼吸科，江蘇徐州221002）

瘦素，為一種相對分子質(zhì)量為16×103的激素，主要由脂肪細胞分泌，在免疫系統(tǒng)和炎癥中起著多方面的作用［1］。瘦素與瘦素受體（OB－R）結(jié)合通過激活磷脂酰肌醇－3－OH激酶和分裂素活化的蛋白激酶（MAPK）信號通路發(fā)揮其作用［2］。瘦素濃度在過敏性氣道中是增加的，可能在肥胖和哮喘的關系中起著作用［3］。但瘦素與瘦素受體的作用通路及發(fā)病機制在哮喘患者的氣道中的作用仍不清楚。最新研究證實瘦素可能在促進氣道炎癥的同時，參與了哮喘的氣道重構(gòu)過程，瘦素失衡可能是肥胖哮喘小鼠氣道損傷和重建的重要因素［4］。本小組前期研究表明瘦素可以促進體外培養(yǎng)的大鼠氣道平滑肌細胞（airway smooth cells，ASMCs）的增殖［5］，但是瘦素對 ASMCs凋亡的影響尚無相關報道。本實驗研究目的旨在探討瘦素是否可通過與ASMCs上瘦素受體的結(jié)合來抑制細胞的凋亡，從而可以進一步的了解瘦素對ASMCs的作用。

1 材料與方法

1.1材料 實驗動物：150～200g SD雌性大鼠2只由徐州醫(yī)學院實驗動物中心提供。主要試劑與儀器：細胞培養(yǎng)基（DMEM）購自GIbIco公司；瘦素購自Alexis公司；兔抗鼠瘦素受體的抗體BY－0961Rleptin receptor（L）購自上海博華生物科技有限公司；兔抗大鼠白血病－xl（Bcl－xl）抗體、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase－3）抗體購自北京中杉公司；Annexin VFITC/PI凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1大鼠ASMCs的培養(yǎng) 水合氯醛麻醉大鼠后，在無菌下剖取氣管約1.5cm放入超凈臺，將氣管段剪成1mm×1 mm的組織塊，貼于培養(yǎng)瓶的側(cè)面，加入含25%胎牛血清（FBS）的培養(yǎng)液2mL于瓶內(nèi)，于37℃含5%CO2培養(yǎng)箱靜置，3～4h之后輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，半開放式于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3d后，添加3mL的培養(yǎng)液于瓶內(nèi)，培養(yǎng)約6d可換液，此后每3天換液1次。待細胞長滿瓶壁后傳代培養(yǎng)，選第4～6代的細胞用于實驗。

1.2.2細胞鑒定 （1）細胞形態(tài)學：倒置顯微鏡觀察細胞的大小、形態(tài)及排列方式等；（2）免疫熒光染色法：把收集好的細胞加入消毒好的6孔培養(yǎng)板內(nèi)，DMEM補齊至2mL。倒置顯微鏡下觀察細胞融合約50%～60%時取出玻片，加3.7%甲醛液在室溫下固定30min，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2次，每次5 min，用0.1%山羊血清封閉特異性抗原30min，抗SMC－α－actin（1∶200PBS稀釋）室溫孵育細胞2h后，加入熒光標記二抗（1∶200PBS稀釋）在4℃孵育過夜，第2天用熒光封片劑封閉后在熒光顯微鏡下檢測。

1.2.3Western blot法檢測瘦素受體蛋白 （1）分別提取未經(jīng)瘦素干預和瘦素干預后的ASMCs蛋白備用。（2）用啉甲酸（BCA）蛋白實驗法測量蛋白的濃度，配膠后，在每個上樣孔中加入30μL的蛋白提取液，電壓80V電泳，電流40mA轉(zhuǎn)膜。然后把纖維膜取出，放入30g/L的封閉液中封閉3h，按一抗∶洗 滌緩沖液（Washing Buffer）∶30g/L 牛血清蛋白（BSA）＝3∶2∶1加入二抗，孵育2h，配制顯色液，緩沖液（AP Buffer）∶四氮唑藍（NBT）∶甲苯胺藍（BCIP）＝10mL∶66μL∶33μL，加入顯色液約2h，用NBT/BCIP顯色后用Image J軟件分析條帶的灰度。

1.2.4Western blot法測定caspase－3和Bcl－xl蛋白的表達方法同上。封閉后，用washing Buffer洗滌3次，分別放入含10%的caspase－3和Bcl－xl抗體孵育，2h后配制顯色液按上述方法顯色后觀察結(jié)果。用NBT/BCIP顯色后用Image J軟件分析條帶的灰度值，計算 Bcl－xl/β－actin和caspase－3/β－actin的比值。

1.2.5Annexin V－FITC/PI測定細胞凋亡率 將第四代的ASMCs按1×105/孔接種于4個6孔板培養(yǎng)24h，再加入純的DMEM培養(yǎng)24h，換1%含血清的DMEM，隨機分為7組：空白對照組（A組）；20μg/mL瘦素組（B組）；40μg/mL瘦素組（C組）；60μg/mL 瘦素組（D 組）；80μg/mL 瘦素組（E 組）；100μg/mL瘦素組（F組）；100μg/mL瘦素＋BY－0961RLeptin receptor組（G組）。將細胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，用胰酶消化收集細胞離心5min。棄上清液后轉(zhuǎn)移至標記好的EP管中。每管中加入Annexin V－FITC輕輕重懸細胞，加入PI避光反應10min，隨即用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.3統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析，實驗結(jié)果以s表示。組間比較采用單因素方差分析和q檢驗。相關性分析采用Pearson等級相關進行統(tǒng)計分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1ASMCs的鑒定 倒置顯微鏡放大100倍，細胞呈長梭形，貼壁平行生長，束狀排列，密集與稀疏處相互交錯（封4圖1A）。免疫熒光染色法證明：抗平滑肌肌動蛋白抗體呈陽性染色的細胞內(nèi)可見大量的綠色熒光，說明所培養(yǎng)的細胞為ASMCs（封4圖1B）。

2.2瘦素受體的鑒定 Western blot法顯示在相對分子質(zhì)量（95～130）×103之間有明顯的條帶。見封4圖2。

2.3瘦素對ASMCs凋亡的影響 瘦素分別作用于ASMCs 48h后，用流式細胞儀檢測各組的凋亡率，B、C、D、E、F組細胞的凋亡率分別為（5.16±0.99）%、（3.45±0.82）%、（2.90±0.18）%、（1.68±0.87）%、（1.08±0.26）%均低于A組（6.48±0.76）%（P＜0.05），且各組細胞凋亡率與瘦素濃度呈負相關（r＝－0.992，P＜0.01），加入瘦素受體抗體的 G組細胞的凋亡率為（3.12±0.76）%，較F組明顯升高（P＜0.05）。

2.4瘦素對caspase－3表達的影響 Western blot表明不同濃度瘦素處理后，ASMCs內(nèi)裂解的caspase－3表達減少，并與濃度呈負相關（r＝－0.932，P＜0.01），見圖3。

2.5瘦素對ASMCs內(nèi)Bcl－xl蛋白的影響 Western blot結(jié)果示隨著瘦素濃度的增加，對抑制細胞凋亡的Bcl－xl蛋白的表達逐漸增多，且與濃度呈正相關（r＝0.974，P＜0.01），見圖4。

圖4 Western blot檢測各組Bcl－xl蛋白的表達

3 討 論

在過去的幾年中，許多的研究證實了瘦素在呼吸系統(tǒng)中潛在作用?；谶@樣的研究，研究者們試圖證明瘦素在特殊的呼吸系統(tǒng)紊亂中的作用，包括慢性阻塞性肺疾?。–OPD）、哮喘、肺癌。本研究證明了瘦素與瘦素受體結(jié)合抑制了大鼠ASMCs的凋亡，瘦素可以使參與細胞凋亡的蛋白caspase－3表達減少，使抑制細胞凋亡的蛋白Bcl－xl表達減少。其中瘦素抑制ASMCs凋亡的作用機制尚在研究之中。

瘦素可以通過STAT－3的活化途徑體外刺激人的單核細胞增殖［6］。而且最近一篇文獻已經(jīng)證明了瘦素受體在大鼠ASMCs上有表達，瘦素與瘦素受體結(jié)合可體外刺激大鼠ASMCs的增殖［5］，這說明它可能在哮喘ASMCs增殖中起著一定的作用。本實驗也證實了瘦素受體在大鼠ASMCs中有表達。而且肺組織中有瘦素受體基因的表達；在一些動物模型實驗中也發(fā)現(xiàn)了肺組織上的瘦素受體［7］，更重要的是，有研究發(fā)現(xiàn)了肺組織細胞中有瘦素受體b型（OB－R b）的表達［8］，本實驗Western blot顯示在95×103與130×103之間有明顯條帶，與瘦素受體OB－R b 120×103的相對分子質(zhì)量相符。說明ASMCs上有長型瘦素受體的表達。

有研究表明瘦素可以避免T淋巴細胞凋亡，調(diào)節(jié)T－Cell的增殖和活化，并促進血管的生成［9］。哮喘是以氣道重塑為主的慢性氣道炎癥，主要表現(xiàn)為氣道內(nèi)上皮細胞的脫落、基底膜的增厚等，且有研究證實了瘦素本身不促進平滑肌的增殖、遷移或細胞因子的合成，這說明了肥胖對哮喘的影響不能歸因于瘦素直接對ASMCs的作用［10］。

有研究證實了瘦素可以通過激活p－ERK和PI－3K的機制體外促進大鼠ASMCs細胞的增殖［5］，而對大鼠ASMCs細胞的凋亡率的影響卻沒有相關的研究。本實驗用不同濃度的瘦素體外刺激大鼠ASMCs 48h后，用流式細胞儀檢測法和Western blot法來觀察瘦素對細胞凋亡的影響；結(jié)果顯示了瘦素可與ASM細胞膜上的瘦素受體結(jié)合通過相應的作用機制及相應的信號轉(zhuǎn)導體系而實現(xiàn)抑制細胞的凋亡，導致裂解的caspase－3的減少，Bcl－xl的增加，并具有明顯的濃度依賴性，于100μg/mL時達到高峰，當在F組中加入BY－0961RLeptin receptor后，實驗發(fā)現(xiàn)ASMCs的凋亡率明顯升高，從而證實了BY－0961RLeptin receptor可通過與受體結(jié)合抑制瘦素對細胞的抗凋亡作用。瘦素也可以保護心肌細胞免受缺氧－再灌注或是過氧化氫誘導的凋亡［11］，說明瘦素在細胞保護中可能起著重要的作用。

caspase家族在細胞凋亡中起著至關重要的作用，caspase－3在凋亡過程中起著重要的作用，細胞凋亡的過程是caspase－3不可逆水解底物的級聯(lián)放大反應過程［12］，它可直接破壞細胞結(jié)構(gòu)，在細胞發(fā)生凋亡時，核纖層蛋白可被caspase－3在一個近中部的固定部位所裂解，使核纖層蛋白崩解，導致細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，不同濃度的瘦素干預ASMCs后，可使裂解的caspase－3蛋白表達明顯增多，且與瘦素濃度呈負相關，說明caspase－3參與瘦素對ASMCs的凋亡作用。

Bcl－xl蛋白是BCL蛋白家族的成員之一，是細胞中抑制細胞凋亡的重要分子之一，Bcl－xl是結(jié)構(gòu)上與Bcl－2具有43%同源性的蛋白與Bcl－2的作用相同，可抑制細胞凋亡。Bcl－xl的過度表達可引起細胞核谷胱苷肽（GSH）的積聚，導致核內(nèi)氧化還原平衡的改變，從而降低caspase－3酶的活性。本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的瘦素可以通過增加Bcl－xl蛋白的表達使caspase－3蛋白減少且與瘦素濃度呈正相關（P＜0.01）。當加入瘦素受體抑制劑時，caspase－3蛋白的表達明顯增多，Bcl－xl蛋白表達明顯減少。這說明了二者在瘦素對ASMCs的抑制凋亡作用中發(fā)揮重要的作用，共同參與細胞的凋亡過程。

總之，瘦素可以在體外與大鼠ASMCs的瘦素受體結(jié)合，增加Bcl－xl的表達，抑制裂解caspase－3的表達，從而實現(xiàn)了對ASMCs的保護。其中的作用機制尚不清楚，可能是PI－3K和MAPK通路發(fā)揮其作用，這有待進一步的研究來證實。

［1］Matarese G，Mantzoros C，La Cava A.Leptin and adipocytokines：bridging the gap between immunity and athero－sclerosis［J］.Curr Pharm Des，2007，13（36）：3676－80.

［2］Conus S，Bruno A，Simon HU.Leptin is an eosinophil survival factor［J］.J Allergy Clin Immunol，2005，116（6）：1228－1234.

［3］Shore SA，Schwartzman IM，Mellema MS，et al.Effect of leptin on allergic airway responses in mice［J］.J Allergy Clin Immunol，2005，115（1）：103－109.

［4］蘇毅，王欣，唐彩月，等.瘦素在肥胖哮喘小鼠氣道重構(gòu)中的作用［J］.實用臨床醫(yī)藥雜志，2010，14（7）：6－9.

［5］何淑敏，朱述陽，李慧婷，等.瘦素對大鼠氣道平滑肌細胞增殖的影響［J］.細胞與分子免疫學雜志，2011，27（8）：849－855.

［6］Matarese G，Moschos S，Mantzoros CS.Leptin in immunology［J］.J Immunol，2005，174（6）：3137－3142.

［7］Hoggard N，Trahum P，Mecer JG.Leptin and leptin receptor mRNA and Proteins expression in the murine foetus and placenta［J］.Proc Natl Aced Science USA，1997，94（20）：11073－11078.

［8］Bruno A，Pace E，chain P，et al.Leptin receptor expression in asthma［J］.J Allergy Clin Immune，2009，124（21）：230－237.

［9］Hersoug LG，Linneberg A.The link between the epidemics of obesity and allergic disease：does obesity induce decreased immune tolerance？［J］.Allergy，2007，62（10）：1205－1213.

［10］Nair P，Radford K，F(xiàn)anat A，et al.The effects of leptin on airway smooth muscle responses［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2008，39（4）：475－481.

［11］Shin EJ，Schram K，Zheng XL，et al.Leptin attenuates hypoxia/reoxygenation－induced activation of the intrinsic pathway of apoptosis in rat H9c2cells［J］.J Cell Physiol，2009，221（2）：490－497.

［12］Lakhani SA，Masud A，Kuida K，et al.caspase 3and 7：key mediators of mitochondrial events of apoptosis［J］.Science，2006，311（5762）：847－851.