肝癌細(xì)胞疫苗對荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞IFN－γ生成及腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的影響＊

蘇 立，周 顰，李正芳，傅 敏，白 平，劉 楠，王智彪

（1.重慶市中醫(yī)院腫瘤科 400011；2.重慶市中醫(yī)院內(nèi)分泌科 400011；3.重慶醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)超聲工程研究所 400016）

研究發(fā)現(xiàn)高強(qiáng)度聚焦超聲（high intensity focused ultrasound，HIFU）輻照腫瘤細(xì)胞制備的腫瘤疫苗（簡稱瘤苗）可使免疫小鼠獲得一定的抗同源腫瘤的免疫力［1］，但瘤苗誘導(dǎo)的動物體內(nèi)免疫功能的變化尚不清楚。T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫是抗腫瘤免疫反應(yīng)的主體，體內(nèi)某些細(xì)胞因子的增多是細(xì)胞免疫活化的標(biāo)志，而淋巴細(xì)胞在腫瘤中的浸潤程度通常被認(rèn)為與腫瘤宿主的預(yù)后相關(guān)［2－3］。本實驗以H22荷瘤小鼠為模型，在觀察HIFU瘤苗免疫小鼠大體抗腫瘤效應(yīng)的基礎(chǔ)上，探討免疫后的荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞干擾素－γ（IFN－γ）生成以及腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）的變化，以了解HIFU瘤苗免疫對小鼠免疫功能的影響。同時以高溫凝固方法制備的瘤苗作對照，比較HIFU瘤苗效能。

1 材料與方法

1.1材料 HIFU腫瘤治療系統(tǒng)由重慶醫(yī)科大學(xué)超聲工程研究所提供；雌性BALB/c小鼠共108只，6～8周齡，體質(zhì)量18～22g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供；H22小鼠肝癌細(xì)胞株由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗細(xì)胞庫提供；兔抗小鼠CD4及兔抗小鼠CD8抗體購自北京博奧森公司，免疫組化SP試劑盒、DAB顯色試劑盒及小鼠IFN－γELISA試劑盒購自北京中杉金橋公司；ELX800酶標(biāo)儀購自美國Bio－Tek公司。

1.2方法

1.2.1制備HIFU和高溫瘤苗 將H22細(xì)胞調(diào)整濃度為1×107/mL，HIFU輻照該細(xì)胞懸液制成HIFU瘤苗，HIFU參數(shù)為：聲強(qiáng)1 054W/cm2、焦距110mm、頻率0.8mHz、時間80s。另取相同的細(xì)胞懸液65℃高溫水浴1h制備高溫瘤苗。

1.2.2小鼠腫瘤體積測量 將60只小鼠，隨機(jī)分為3組，每組20只，每組分別接受HIFU瘤苗、高溫瘤苗及生理鹽水皮下注射，每只0.2mL，每周1次，連續(xù)4周，第5周以對數(shù)生長期的H22細(xì)胞4×106個/只小鼠腋前皮下注射。接種后游標(biāo)卡尺每周測量小鼠瘤體長徑（a）與橫徑（b），以（a×b2）/2計算腫瘤體積［4］。

1.2.3小鼠脾淋巴細(xì)胞IFN－γ生成水平檢測 小鼠18只，分3組，每組6只，每組分別接受HIFU瘤苗、高溫瘤苗、生理鹽水皮下注射及再接種H22細(xì)胞同前，接種H22細(xì)胞后1周處死，無菌取脾，于金屬篩網(wǎng)上剪碎研磨，收集勻漿以小鼠淋巴細(xì)胞分離液梯度離心，獲得脾淋巴細(xì)胞懸液。取此淋巴細(xì)胞2×104個與H22細(xì)胞2×103個混合加入96孔板，在含10%FBS的RPMI1640中共育48h，每組設(shè)3個復(fù)孔，之后1 500r/min離心10min，取上清液用ELISA法測IFN－γ。ELISA按試劑盒說明步驟進(jìn)行，以酶標(biāo)儀測492nm波長處吸光值。

1.2.4免疫組化 將30只小鼠，分3組，每組10只，按同樣方法分別免疫并接種，接種H22細(xì)胞2周后處死小鼠，切取其皮下腫瘤，4%中性多聚甲醛固定、常規(guī)脫水、石蠟包埋，5μm切片。免疫組化按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.5TIL半定量分析 鏡下細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)顯現(xiàn)棕黃色判定為CD4＋或CD8＋細(xì)胞。陽性細(xì)胞半定量分析參考文獻(xiàn)［2－3］方法：每個標(biāo)本鏡下隨機(jī)選取10個高倍視野（×200），以腫瘤內(nèi)部陽性細(xì)胞分布最豐富的3個視野作為計數(shù)范圍。根據(jù)視野內(nèi)平均陽性細(xì)胞數(shù)（1～＜20、20～＜50、≥50），將細(xì)胞浸潤程度分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3個等級。計數(shù)時排除腫瘤邊緣及壞死區(qū)域。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，腫瘤體積數(shù)據(jù)用析因方差分析，腫瘤淋巴細(xì)胞浸潤結(jié)果行Mann－Whiney U秩和檢驗，其他數(shù)據(jù)行單因素方差分析，計量數(shù)據(jù)結(jié)果以s表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠腫瘤體積和生存期比較 因生理鹽水組小鼠在接種H22細(xì)胞21d后出現(xiàn)較多死亡，故記錄21d內(nèi)各組的腫瘤體積。21d內(nèi)生理鹽水組小鼠死亡2只，按死亡時腫瘤體積記錄，結(jié)果顯示各組小鼠間腫瘤體積有差異，21d時生理鹽水組腫瘤體積為（3 509±524）mm3，高溫瘤苗組為（2 001±472）mm3，HIFU瘤苗組為（1 601±383）mm3（P＜0.05），見圖1。觀察生存情況至6周，各組小鼠生存期存在明顯差異，平均生存期生理鹽水組為（23.3±1.0）d、高溫瘤苗組為（31.8±0.9）d，HIFU瘤苗組為（35.7±1.1）d（P＜0.05），見圖2。

圖1 接種H22細(xì)胞21d內(nèi)各組小鼠的腫瘤體積比較

2.2小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IFN－γ水平 各組小鼠免疫后在H22細(xì)胞的再刺激下，其脾淋巴細(xì)胞IFN－γ分泌水平為：生理鹽水組（1 133±208）pg/mL，高溫瘤苗組（6 333±351）pg/mL，HIFU瘤苗組（9 366±1 026）pg/mL，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3瘤苗對各組小鼠TIL的影響 兩種瘤苗免疫的荷瘤小鼠腫瘤組織中CD4＋、CD8＋細(xì)胞浸潤均較明顯。根據(jù)陽性細(xì)胞浸潤分級計算，高溫瘤苗及HIFU瘤苗組腫瘤組織內(nèi)CD4＋、CD8＋細(xì)胞浸潤程度較生理鹽水組有顯著提高（P＜0.05），兩種瘤苗組間TIL浸潤程度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

圖2 接種H22細(xì)胞后各組小鼠的生存曲線

表1 各組小鼠腫瘤淋巴細(xì)胞浸潤程度的分布（n＝10）

3 討 論

腫瘤疫苗作為腫瘤免疫治療的重要部分被廣泛研究，其種類較多，包括腫瘤細(xì)胞疫苗、樹突狀細(xì)胞疫苗、腫瘤肽類疫苗及腫瘤DNA疫苗等［5］，又可依據(jù)針對腫瘤抗原的不同分為全腫瘤細(xì)胞即多表位疫苗和特定抗原表位疫苗。全腫瘤細(xì)胞疫苗攜帶了完整的腫瘤抗原庫，無需篩選腫瘤特異性抗原，這是全腫瘤細(xì)胞疫苗相對特定抗原疫苗的優(yōu)勢。目前滅活腫瘤細(xì)胞已獲得全腫瘤細(xì)胞疫苗的方法有：反復(fù)凍融、熱凝固、放射輻照、紫外線照射、甲醛固定及光動力殺傷等，但有的方法效果并不理想［6］，本研究以HIFU輻照腫瘤細(xì)胞制備疫苗，為研制腫瘤疫苗提供了一種新方法，HIFU瘤苗免疫小鼠后大體觀察發(fā)現(xiàn)腫瘤生長受抑制，小鼠生存期延長，提示HIFU瘤苗具有提高實驗動物抗腫瘤免疫力的效果。

抗腫瘤免疫的主體是細(xì)胞免疫，由1型輔助性T細(xì)胞（Th1）介導(dǎo)，而2型輔助性T細(xì)胞（Th2）介導(dǎo)免疫應(yīng)答向體液免疫發(fā)展。Th1細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子主要是IFN－γ、IL－2，而Th2細(xì)胞主要分泌IL－4、IL－5。Th1類和Th2類細(xì)胞因子的平衡決定了哪種免疫反應(yīng)占主導(dǎo)地位，Th細(xì)胞由分泌Th1類細(xì)胞因子向Th2類因子轉(zhuǎn)換可能是抗腫瘤免疫失效的機(jī)制之一［7］。IFN－γ也可由活化的CD8＋細(xì)胞分泌，主要是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）分泌，故IFN－γ水平增高可以作為是細(xì)胞免疫增強(qiáng)和CTL活化的標(biāo)志，這對抗腫瘤是有益的。本實驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)HIFU瘤苗免疫，荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞在同源腫瘤再刺激下IFN－γ生成較未免疫小鼠成倍增加，提示經(jīng)瘤苗免疫小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了對該腫瘤敏感的淋巴細(xì)胞群，也表明細(xì)胞免疫的增強(qiáng)及CTL細(xì)胞激活。

免疫組化結(jié)果顯示兩種瘤苗免疫后小鼠TIL數(shù)量較未免疫組有顯著提高。文獻(xiàn)報道TIL數(shù)量是有利于宿主的預(yù)后因子，如CD4＋和CD8＋細(xì)胞浸潤較多的食管鱗癌患者有較長的生存期［3］，而CD3＋細(xì)胞在腫瘤周邊浸潤較少是宮頸癌復(fù)發(fā)的高危因素［8］。有研究表明腫瘤實質(zhì)中的TIL數(shù)量比腫瘤間質(zhì)或邊緣的TIL數(shù)量和預(yù)后的關(guān)系更加確切［9］，本實驗中以腫瘤實質(zhì)內(nèi)的TIL為觀察對象，發(fā)現(xiàn)瘤苗組腫瘤浸潤C(jī)D4＋和CD8＋細(xì)胞較未免疫組增多，這與觀察到的免疫小鼠腫瘤生長受抑制是吻合的。腫瘤生長抑制和動物生存期延長在HIFU瘤苗組較高溫瘤苗組更加明顯，但兩種瘤苗組間TIL浸潤程度無顯著差異，其原因可能在于除TIL的數(shù)量外，宿主預(yù)后與TIL之間還存在其他的影響因素［10］，如TIL的具體類型被認(rèn)為是另一重要的預(yù)后因素，CD4＋輔助細(xì)胞被認(rèn)為對誘導(dǎo)CTL產(chǎn)生及維持CTL記憶有明確作用，而CD4＋細(xì)胞中的調(diào)節(jié)T細(xì)胞（Treg）亞群，則可能下調(diào)抗腫瘤免疫反應(yīng)［7］。本實驗中未能區(qū)分CD4＋細(xì)胞的具體亞群，另外由于本實驗中樣本數(shù)較少且免疫組化及半定量的方法檢驗效能有限，可能未顯示出兩組潛在的差別。

為了衡量HIFU瘤苗的效能本研究以熱凝固方法制備高溫瘤苗作對照，理論上二者同屬全腫瘤細(xì)胞疫苗，包含了相同的腫瘤抗原，且在本實驗參數(shù)條件下HIFU輻照對細(xì)胞也產(chǎn)生65℃左右的熱效應(yīng)，但實驗結(jié)果顯示HIFU瘤苗效能優(yōu)于高溫瘤苗，其機(jī)制并不清楚，這可能與HIFU輻照對細(xì)胞產(chǎn)生的特殊的生物學(xué)效應(yīng)有關(guān)，HIFU輻照除產(chǎn)生熱效應(yīng)外，還對細(xì)胞形成特有的機(jī)械效應(yīng)及空化效應(yīng)。近來研究認(rèn)為細(xì)胞死亡時的某些物質(zhì)釋放能激活免疫，這是一些被稱作“危險信號”或“損傷相關(guān)分子形式”的物質(zhì)，如：熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）、核苷酸、鈣網(wǎng)蛋白等［11－13］。研究顯示 HIFU 的機(jī)械和空化效應(yīng)比HIFU的熱效應(yīng)更有利于輻照細(xì)胞“危險信號”的釋放［14］，而HIFU的輻照也促使細(xì)胞釋放“損傷相關(guān)分子形式”之一的HSP［15］，這可能是HIFU輻照瘤苗比單純熱凝固細(xì)胞瘤苗免疫效能更高的原因之一。

綜上所述，HIFU制備瘤苗的免疫能明顯抑制同源移植腫瘤在動物體內(nèi)的生長，延長實驗動物的生存期。腫瘤刺激下HIFU瘤苗免疫動物的脾淋巴細(xì)胞IFN－γ生成增高，提示機(jī)體細(xì)胞免疫被激活。腫瘤生長受抑制可能與增多的淋巴細(xì)胞浸潤有關(guān)。

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