豬日本腦炎病毒NS3蛋白的基因克隆、原核表達及純化＊

韓秀杰，張保新，趙凡凡，余風(fēng)艷，沈紅霞，王曉杜

（浙江農(nóng)林大學(xué)動物科技學(xué)院，浙江 臨安 311300）

日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV），又稱乙型腦炎病毒，屬于黃病毒科黃病毒屬單股正鏈RNA病毒，它可引起以中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害為主的蟲媒性人畜共患病，即日本腦炎或乙型腦炎[1]。每年在全球有30000～50000個乙型腦炎病例，其中超過10000人死亡，乙型腦炎廣泛分布于東南亞各地區(qū)，而我國是乙型腦炎發(fā)病人數(shù)最多的國家之一，占世界總發(fā)病數(shù)的80%以上[2]，幸存者約有一半留有嚴(yán)重的神經(jīng)和精神后遺癥。而在動物中豬是JEV的主要感染對象和寄存宿主，種豬感染JEV后表現(xiàn)為繁殖機能障礙，母豬表現(xiàn)為產(chǎn)死胎、木乃伊胎等。該病的發(fā)生既嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的健康發(fā)展，同時也對公共衛(wèi)生具有重要的影響。

JEV的基因組為單股、正鏈RNA分子，其長度約為11kb（10976bp），裸露的病毒RNA有感染性。在宿主和病毒蛋白酶的切割下，JEV產(chǎn)生3種結(jié)構(gòu)蛋白，即C蛋白（殼／核心蛋白）、PrM／M（膜前體蛋白／膜蛋白）和E蛋白（囊膜糖蛋白）以及7種非結(jié)構(gòu)白，即 NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5[3]。自從該病毒產(chǎn)生以來，進化出5種基因型，逐漸遍布整個亞洲[4]。

JEV NS3基因全長約1850bp，編碼蛋白的分子質(zhì)量為64ku。它是一個具有絲氨酸蛋白酶、螺旋酶、核苷酸5′磷酸酶的活性蛋白質(zhì)，在病毒前體蛋白剪切和基因組RNA復(fù)制中具有重要作用[5]。有研究表明NS2B－NS3蛋白酶復(fù)合物的形成，有利于C－prM前體的剪切加工，并使C和prM分泌增加[6]。在JEV感染細(xì)胞中，NS3與微管和腫瘤敏感基因101蛋白密切相關(guān)，在病毒的RNA裝配、病毒成分胞內(nèi)運輸以及病毒的裝配中發(fā)揮重要作用[7－9]。NS3主要定位在JEV誘導(dǎo)的膜泡上，該膜泡是病毒成分貯存主要場所，NS3蛋白有利于病毒的裝配。Chen C J等[10]。研究表明，NS3和NS5在體內(nèi)相互作用形成蛋白復(fù)合物，繼而與3′端非編碼區(qū)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)形成復(fù)制復(fù)合體，參與負(fù)鏈RNA的合成。因此，NS3蛋白可能是一個潛在的藥物靶標(biāo)分子，在抗JEV病毒藥物開發(fā)方面具有重要作用[9]。

本研究擬克隆豬日本腦炎病毒的NS3基因，構(gòu)建重組原核表達載體，在大腸埃希菌中大量表達，并純化該重組蛋白，鑒定其免疫學(xué)活性，為探討該蛋白的功能及病毒復(fù)制的相關(guān)研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

豬日本腦炎病毒SH－JEV01毒株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所馬志永研究員惠贈；BHK－21細(xì)胞原核表達載體pET－28（a）、大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞、DH5α和BL21（DE3）由浙江農(nóng)林大學(xué)獸醫(yī)微生物學(xué)實驗室保存。

DNA Marker DL 2000，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SalⅠ，AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒，Taq DNA聚合酶等購自寶生物工程（大連）有限公司；T4DNA ligase購自 NEB公司；異丙基硫代－β－D－半乳糖苷（IPTG）購自Sigma公司；Trizol購自invitrogen公司；UNIQ－10柱式DNA膠回收試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司，A型小量DNA片段快速純化回收試劑盒購于北京博大泰克基因技術(shù)有限公司；質(zhì)粒DNA小量試劑盒購自上海華舜生物公司。其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 病毒基因組RNA的提取 將JEV感染的BHK－21細(xì)胞樣品重懸于 Trizol試劑中，室溫10min后，加入1／3體積的氯仿，反復(fù)混勻后室溫5min。以15000r／min離心15min，小心吸取上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入等體積的異丙醇，反復(fù)混勻后室溫沉淀5min，以15000r／min離心15min。去掉上清后，用700ml／L乙醇洗滌沉淀1次，室溫干燥后，溶于適量的RNase free水中，置－20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RT－PCR 擴增JEV NS3基因 根據(jù) AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書上的方法，將上面提取的病毒基因組RNA，利用隨機引物擴增下合成cDNA。以此cDNA 為模板，引物 F：5′GCGGAATTCATGGGGGGCGTGTTTG 3′；R：5′GCGGTCGACTTATCTCTTCCCTGCT 3′，在PCR管中加入如下20μL體系：RNA se Free ddH2O，14.3μL；10 ×buffer 2μL；dNTPs 1.6μL；10μmol／L 引物各0.4μL；Taq酶0.3μL；cDNA模板1μL。在PCR儀中以下面條件進行PCR擴增：94℃5min；94℃50s，58℃50s，72℃2min，共35個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃10min，最后4℃終止反應(yīng)。10g／L瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.2.3 pET－28（a）－JEV－NS3重組質(zhì)粒構(gòu)建 將上述膠回收的JEV－NS3的PCR產(chǎn)物和pET－28（a）空載體分別用EcoRⅠ、SalⅠ酶進行雙酶切，酶切回收后，在T4連接酶作用下，把JEV－NS3亞克隆到pET－28（a）質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌 DH5α，挑取克隆經(jīng)PCR和雙酶切鑒定為陽性者，送上海英駿生物公司測序鑒定。

1.2.4 重組蛋白JEV－NS3的誘導(dǎo)表達 將上述鑒定好的陽性重組質(zhì)粒pET－28（a）－JEV－NS3轉(zhuǎn)化到E.coli BL21（DE3）內(nèi)，挑取克隆擴大培養(yǎng)，細(xì)菌生長到對數(shù)期時加入1mmol／L的IPTG，誘導(dǎo)3h后，取樣并煮沸制備樣品，SDS－PAGE電泳檢測重組JEV NS3蛋白表達情況。

1.2.5 重組JEV NS3蛋白的包涵體提取與純化將1.2.4鑒定好的表達JEV NS3蛋白的陽性克隆擴大到100mL進行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)菌生長到對數(shù)期時，加入1mmol／L的IPTG，誘導(dǎo)表達3h后，收集菌體，按照王曉杜等[11]方法提取包涵體，并對溶解的包涵體進行復(fù)性，透析后制備大量可溶性的重組JEV NS3蛋白。SDS－PAGE檢測該蛋白包涵體提取和復(fù)性效果。

2 結(jié)果

2.1 JEV NS3基因RT－PCR 結(jié)果

以JEV的cDNA為模板，RT－PCR擴增JEV NS3的基因片段，在該片段前面加上起始密碼子ATG和后面加上終止密碼子TAA，引物兩端分別加有EcoRⅠ、SalⅠ酶切位點。擴增的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得大小1.8kb左右的片段，與預(yù)期大小基本一致（圖1）。

圖1 JEV－NS3基因的RT－PCR擴增結(jié)果Fig.1 Amplification of JEV NS3gene by RT－PCR

2.2 重組質(zhì)粒pET－28（a）－JEV NS3的構(gòu)建

JEV NS3基因的PCR產(chǎn)物、pET－28（a）空載體分別用EcoRⅠ、SalⅠ酶進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)T4連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α后，經(jīng)菌落PCR鑒定為陽性的克隆，擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，質(zhì)粒再進一步用EcoRⅠ、SalⅠ酶進行雙酶切鑒定（圖2），結(jié)果為陽性的克隆送生物公司測序，測序結(jié)果經(jīng)NCBI上Blast比對表明，本研究克隆到了JEV NS3基因，該片段與NCBI上公布的序列（GenBank No：AF069076）同源性高達97%。

圖2 pET－28（a）－JEV－NS3重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pET－28（a）－JEV NS3by restrict enzyme digestion

2.3 重組JEV－NS3蛋白的誘導(dǎo)表達

上述鑒定好的陽性pET－28（a）－JEV NS3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21（DE3），挑取克隆擴大培養(yǎng)3h后，1mmol／L IPTG誘導(dǎo)3h，分別在誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后取樣，煮沸裂解細(xì)菌，SDS－PAGE電泳檢測重組蛋白表達情況。結(jié)果表明重組蛋白JEV NS3在大腸埃希菌內(nèi)大量表達（圖3），分子質(zhì)量為64ku，與預(yù)期大小一致。薄層掃描分析表明，表達的重組蛋白占總菌體蛋白的30%以上。

2.4 重組JEV NS3蛋白的包涵體提取和純化

為了獲得高純度的重組JEV NS3蛋白，把上述鑒定能表達重組蛋白的克隆擴大培養(yǎng)到100mL，收集菌體后，利用溶菌酶裂解和超聲破碎菌體，高速離心收集沉淀，沉淀用脫氧膽酸鈉處理后，變性劑十二烷基肌氨酸鈉溶解包涵體，然后利用還原型和氧化型谷胱甘肽復(fù)性重組蛋白，透析除去變性劑后，PEG濃縮蛋白。在每一個步驟取樣，SDS－PAGE檢測純化效果。結(jié)果表明，重組蛋白主要在包涵體中，上清中沒有表達，純化后檢測發(fā)現(xiàn)該方法獲得較好的純化效果，薄層掃描分析表明，純化后重組蛋白占總蛋白的70%以上（圖4）。

圖3 重組JEV NS3蛋白的誘導(dǎo)表達Fig.3 Expression of recombinant protein JEV NS3by IPTG induction

圖4 重組JEV NS3蛋白包涵體的提取和純化效果檢測Fig.4 Extraction and purification of recombinant protein JEV NS3inclusion body

3 討論

豬是JEV的天然宿主之一，病毒能在豬群中大量繁殖，經(jīng)蚊蟲再傳播給人，所以控制該病在豬群中的發(fā)生具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。除此之外，JEV引起的母豬繁殖障礙給養(yǎng)豬業(yè)也帶來了重大危害，監(jiān)測該病的流行情況，控制其在豬群中的擴散，研發(fā)抗病毒藥物等措施都有利于該病的防控。

NS3蛋白在病毒RNA的復(fù)制和病毒包裝等方面具有十分重要的功能，同時NS3蛋白在誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答和致病性方面也具有重要作用。它是誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的主要抗原之一[12]，同時也能激活胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白活性，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[13]。本研究克隆了從豬群中分離的神經(jīng)毒JEV病毒株的NS3基因，該序列與NCBI上公布序列同源性97%以上，在原核表達系統(tǒng)中大量表達重組蛋白JEV NS3，表達量達到菌體總蛋白的30%以上，純化后重組蛋白能占到總蛋白的70%以上。本研究利用前人的方法[11]獲得較純的NS3重組蛋白，為制備該蛋白的抗體，研究其病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫中作用和探討其在病毒致病中的機理奠定了較好的基礎(chǔ)。

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