越橘查耳酮合酶基因的克隆及表達分析1)

李曉艷 裴嘉博 張志東 吳 林 劉海廣 李亞東

(吉林農業(yè)大學，長春，130118)

李海燕

(教育部生物反應器與藥物開發(fā)工程研究中心(吉林農業(yè)大學))

花色素苷和類黃酮化合物廣泛存在于高等植物中，是植物花和果實等幾乎所有色澤形成的物質基礎，并起到保護植物免受紫外線和病原體損傷的功能［1］。查耳酮合酶(CHS，EC2.3.1.74)是類黃酮生物合成途徑的第一個關鍵酶，它催化1分子4－香豆酰CoA與3分子丙二酰CoA縮合形成含15個碳原子的查耳酮，為類黃酮提供了基本的碳骨架，是一個重要的中間產物。自1983年克隆第一個查耳酮合酶基因(CHS)［2］以來，CHS就成為科學家感興趣的一個模式基因，用于研究基因表達和基因家族的進化，并且已經在許多植物中相繼分離克隆出來［3－9］。由于查耳酮合酶在花色素苷合成途徑中的重要作用，科學家利用正抑制和反抑制等方法抑制CHS基因的表達，從而減少花色素苷的合成和累積，達到改變植物花的顏色，培育新品種的目的［10］。

越橘(Vaccinium spp.)俗稱藍莓，由于果實富含花色素苷等對人體健康有益的抗氧化物質而備受關注?；ㄉ剀盏纳锖铣赏緩绞窃介俟麑嵆墒爝^程中最主要的次生代謝途徑之一，通過分離和鑒定越橘花色素苷合成途徑的關鍵酶及相關基因，是深入了解和調控越橘果實花色素苷合成的重要方法。但是目前越橘基因組數據的缺乏給越橘花色素苷等次生代謝途徑的研究帶來了困難，用新一代測序技術(Illumina/Solexa sequencing)對越橘果實的轉錄組進行測序，并以測序文庫中高表達的Unigene23486片段為基礎，利用RT－PCR和RACE技術對越橘CHS基因的全長cDNA序列進行克隆，分析該基因的表達與其酶活性和花色素苷累積的關系，從功能基因組水平上研究越橘花色素苷合成途徑中重要基因的表達，為進一步研究越橘花色素苷形成的分子機制和培育越橘新品種奠定基礎。

1 材料與方法

以越橘品種‘北陸’(V.corymbosum L.)為試材，試驗材料來源于吉林農業(yè)大學小漿果試驗基地。材料分別于花期(2010年5月25日)、綠果期(花后25 d)、粉果期(花后45 d)、藍果期(花后50 d)采集。取藍果期(成熟期)的果實，將果肉和果皮迅速分離，各組織液氮速凍處理后，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

越橘VcCHS基因cDNA全長序列的獲得:果皮RNA提取采用北京奧萊博生物技術有限責任公司生產的植物總RNA提取試劑盒。根據Illumina測序(數據已上傳至NCBI Short Read Archive數據庫，登錄號:SRA046311)產生的在果皮文庫中高表達的序列Unigene23486(440 bp)設計1對特異引物CHSF和 CHS－R(表 1)，以 DNaseⅠ酶(RNase free)消化處理后的RNA反轉錄產物cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增。擴增條件為:94℃預變性3 min;94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30個循環(huán);最后72℃延伸7 min。切膠回收與預期片段大小一致的泳帶，連接克隆載體并轉化感受態(tài)細胞，通過藍白斑篩選及質粒酶切鑒定陽性克隆后測序。根據所得的cDNA片段的中間序列，分別設計特異引物 VcCHS 3'GSP和 VcCHS 5'GSP(表 1)，按照RACE試劑盒SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit說明書進行cDNA末端快速擴增。凝膠回收、產物克隆及序列測定如上所述。為獲得越橘VcCHS基因全長，根據由中間序列和末端序列拼接而得到的cDNA全長序列，設計1對特異引物VcCHS F和VcCHS R(表1)，以 DNaseⅠ酶(RNase free)消化處理后的越橘果皮總RNA反轉錄產物為模板進行PCR擴增。測序結果在 GenBank中進行 Blast分析。利用在線軟件ProtParam預測所編碼蛋白的相對分子質量、理論等電點及保守結構域等。采用DNAMAN和MEGA軟件進行多序列比對及系統(tǒng)進化分析。

相對熒光定量PCR表達分析:用北京百泰克生物技術有限公司生產的適合多糖多酚植物RNA提取試劑盒分別對‘北陸’的花、綠果、粉果、藍果、果肉和果皮的總RNA進行提取，用DNaseⅠ酶(RNase free)消化基因組DNA后，各取1 μg為模板，用MMuLV First cDNA Synthesis Kit(Promega)反轉錄合成cDNA第一鏈備用。根據VcCHS cDNA全長序列，按照熒光定量PCR引物設計原則在VcCHS的3'非翻譯區(qū)附近設計1對特異引物P1和P2(表1)，獲得的擴增片段為92 bp。以 GAPDH(GenBank AY123769)為內參，設計其特異引物GAPDH－F和GAPDH－R(表1)，獲得的擴增片段為116 bp，對照樣品是以綠果提取的RNA為模板，根據GAPDH設計引物C1和C2。對反轉錄所得的cDNA分別進行5倍梯度稀釋(1、1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000)，實施熒光定量反應，然后繪制相對標準曲線。熒光定量PCR擴增的反應體系20 μL:cDNA模板 1 μL，2 × SYBR PremixEx TaqTM10 μL，上下游特異引物(10 μmol·L－1)各 0.4 μL，水 8.2 μL。擴增采用兩步法標準程序:95℃預變性2 min;95℃變性15 s，60 ℃復性15 s，72 ℃延伸30 s，40 個循環(huán)，每個循環(huán)第3步進行熒光采集;最后95℃變性1 min，退火至55℃，保溫1 min后以0.2℃·s－1的速度逐漸升溫至95℃ ，在此過程中連續(xù)檢測其熒光值，繪制熔點曲線。每個試驗設3次重復。

表1 越橘VcCHS基因克隆及表達分析所用引物

花色素苷相對含量測定:花色素苷相對含量測定參照 Pirie［11］及王惠聰等［12］的方法并加以優(yōu)化，將材料切碎充分混合，取1.0 g鮮樣放入20 mL 1%HCl甲醇溶液室溫浸提2 h。取2 mL浸提液，用1%HCl/甲醇溶液稀釋6倍，以1%HCl/甲醇溶液作為空白，用分光光度計測定提取液在553、600 nm處的吸光值，兩者之差即為花色素苷的相對含量。差值每增加0.01定義為1個單位。設3次取樣重復。

2 結果與分析

2.1 越橘VcCHS基因cDNA全長的獲得及序列分析

以果皮RNA反轉錄的cDNA為模板，CHS－F和CHS－R為引物，擴增出一條440 bp的單一特異性條帶(圖1，A)，陰性對照未加模板?；厥占兓a物后經測序與預期結果一致。以VcCHS3'GSP和VcCHS5'GSP為引物，經RACE－PCR擴增和產物克隆、測序后，分別得到長度為1 169 bp的3'端和474 bp的5'末端(圖1B)。根據3'RACE和5'RACE測序結果拼讀出越橘查耳酮合酶基因，并將其與全長引物VcCHS F和VcCHS R擴增所得的序列(圖1C)進行比較，最終獲得一條長為1 438 bp的cDNA全長序列，命名該基因為VcCHS(GenBank登錄號為JN654702)。利用NCBI提供的ORF Finder進行分析發(fā)現，VcCHS包含一個長度為1 260 bp的開放讀碼框(open reading frame，ORF)和一個 poly(A)尾巴，5'非翻譯區(qū)長 107 bp，3'非翻譯區(qū)長 71 bp(圖2)。其ORF編碼一個含419個氨基酸的蛋白質，包括起始密碼子和終止密碼子。利用在線軟件Prot-Param預測所編碼蛋白的相對分子質量為45.7 kD，理論等電點(pI)為8.21。

圖1 越橘VcCHS基因的PCR擴增電泳圖

2.2 VcCHS基因編碼產物的功能分析與同源性比較

為進一步分析越橘CHS與其他物種CHS的同源性，利用DNAMAN5.2.2軟件對包括越橘在內的15個物種的CHS的氨基酸序列進行了多重比對。結果如圖3，越橘VcCHS基因編碼的氨基酸序列與其他已知植物的氨基酸序列有很高的同源性，平均達到86.76%;與葡萄(AEP17004)相似性高達90.2%;與同是杜鵑花目的植物山茶(BAA05641)、杜鵑花(CAC88858)相似性較高，分別達到86.4%和84.8%;而與番茄(AEK99072)相似性相對較低，為81.0%。利用NCBI Conserved Domain Search進行保守域分析表明，越橘CHS的ORF十分保守，編碼的蛋白具有的兩個保守域，即cd00831(CHS_like，Chalcone and stilbene synthases，type IIIplantspecificpolyketide synthases，Ⅲ型聚酮合成酶)和PLN03173(chalcone synthase;Provisional)。進一步的功能位點分析發(fā)現，越橘CHS含有多個查耳酮合酶起功能作用所必需的活性位點，這些活性位點使底物能夠和查耳酮合酶結合發(fā)生催化反應，其位點是:Cys(C)164、His(H)303和 Asn(N)336;CoA 結合位點:Lys(K)55、Arg(R)58、Met(M)59、Phe(F)265、Gly(G)306、Pro(P)307和 Ala(A)308。這些位點幾乎在所有CHS中都高度保守，且各位點的相對位置保持不變(圖3)。另外，利用 prosite軟件對越橘CHS序列的功能位點分析表明，VcCHS基因編碼的氨基酸序列還具有查耳酮合酶基因家族的特征多肽序列:RLMMYQQGCFAGGTVLR(圖3)。

在多重比對的基礎上，為進一步分析越橘CHS與其他植物CHS之間的進化關系，利用MEGA 4.0軟件，對越橘和上述14種已知植物CHS結構域蛋白進行進化樹分析，結果(圖4)表明，越橘CHS的進化基本符合植物分類學分類，并具有明顯的種屬特性，除了紫花苜蓿(AAA02827)外，同屬于薔薇科的幾個物種聚為一類，茄科植物聚為一類。越橘VcCHS(JN654702)基因編碼的氨基酸序列越橘CHS與同是杜鵑花目的山茶(BAA05641)和杜鵑花(CAC88858)聚為一類。

2.3 VcCHS基因的組織特異性表達

采用熒光定量PCR的方法對VcCHS基因在越橘不同組織中的表達量進行了檢測，以綠果作為對照，表達量定為“1”，按照⊿⊿Ct作圖，⊿⊿ Ct=()處理組－()未處理組，Ct值:表示擴增產物的熒光信號達到設定的閾值時所經過 的擴增循環(huán)數。

圖2 越橘VcCHS基因cDNA全長及推導的氨基酸序列

結果(圖5)表明，從越橘開花到果實成熟的整個發(fā)育過程中都能檢測到VcCHS的表達。在果實發(fā)育不同時期，VcCHS的相對表達量和花色素苷相對含量在藍果期顯著高于其他時期(p＜0.05)，二者均是在果皮組織中達到最大值。VcCHS相對表達量與花色素苷相對含量之間具有正對應關系。

3 結論與討論

本研究以Illumina測序產生的片段為基礎，通過RT－PCR和RACE方法從越橘果皮中成功分離出CHS的同源基因VcCHS，該基因編碼的蛋白質具有CHS家族保守存在的活性位點和特征多肽序列，進行基因序列同源性分析發(fā)現，CHS基因編碼區(qū)保守性很強，不同科植物間氨基酸水平上的同源性達86.76%。這與之前的研究結果相一致，即認為CHS編碼區(qū)有很高的保守性，不同科植物間，在DNA水平上的同源性大于60%，在氨基酸水平上的同源性達80%［13］。系統(tǒng)進化分析表明越橘CHS的進化具有明顯的種屬特性，與同是杜鵑花目的植物山茶和杜鵑花親緣關系最近，與茄科植物親緣關系較遠。利用實時熒光定量PCR對VcCHS基因在越橘不同組織中的表達量進行了檢測，在整個果實發(fā)育的過程中都能檢測到VcCHS基因的表達，花期和果實成熟期表達量較高，這與 Jaakola et al.［14］用 Northern－blotting方法檢測CHS基因在歐洲越橘(Vaccinium myrtillus L.)果實發(fā)育不同時期的檢測結果一致。

圖3 越橘VcCHS基因主要ORF推導的氨基酸序列與其他物種CHS多重比對分析

CHS是花色素苷代謝途徑中的第一個限速酶，在類黃酮的代謝途徑上查耳酮分子的異構化和功能基團的進一步取代都能導致黃酮、異黃酮和花色素苷的合成，從而使花色、葉色和果實色澤發(fā)生變化［15］。越橘VcCHS基因的表達量與花色素苷的蓄積量都是在果皮組織中達到最高，這與荔枝［16］的研究結果相似，說明CHS基因相對表達量變化與花色素苷相對含量的變化趨勢具有一致性，并具有一定的組織特異性。從而推測CHS可能是越橘花色素苷合成途徑的主要限速酶之一，在轉錄水平上對越橘果實花色素苷的形成起調控作用。

圖4 越橘VcCHS與其他物種CHS氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹分析

圖5 越橘果實發(fā)育的不同階段和VcCHS的組織特異性表達

不同植物的CHS基因序列同源性很高，但功能上存在明顯差異，CHS幾乎在所有植物中都是以多基因家族存在，研究表明被子植物中至少有兩個基因，在茄科和豆科植物中甚至檢測到8個以上的CHS基因［17－18］。如在矮牽牛中檢測到的8個CHS，多數在花組織中表達，主要與花色素苷的累積有關［19］;在苜蓿中，CHS 主要在花和葉中表達［20］;在山茶的莖和葉中檢測到CHS，并發(fā)現其參與兒茶素的合成［21］。通過Illlumia測序技術對越橘果實進行轉錄組測序，經過短序列拼接組裝、比對和功能注釋，研究發(fā)現多個序列比對到CHS，所以肯定越橘的CHS也是多基因家族，接下來將通過基因工程的手段構建植物正義和反義表達載體轉化煙草和番茄，對越橘VcCHS基因的功能進行進一步的研究和探討。

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