反相高效液相色譜法測定抑毒調(diào)肝合劑中丹參素鈉含量＊

羅宏麗，馮碧敏，肖順林

抑毒調(diào)肝合劑是由丹參、黃精、黨參、貫仲、虎杖5味中藥經(jīng)水煮醇沉制成的中藥復(fù)方制劑，服用方便，具有補(bǔ)氣、解毒、調(diào)肝、健脾的作用，臨床用于治療癥見疲乏無力、不思飲食、肝區(qū)隱痛、自汗的慢性肝炎患者。方中丹參為主藥，丹參素鈉為其主要有效成分之一，該制劑現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)無含量測定項(xiàng)。為了更好地控制制劑的內(nèi)在質(zhì)量，筆者采用反相高效液相色譜(RP－HPLC)法測定了抑毒調(diào)肝合劑中丹參素鈉的含量，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Dionex Ultimate 3000型高效液相色譜儀(美國戴安公司);Kromasystem 2000色譜工作站(Bio.Tek Instrument Snl公司);Hamiltn ASO－0023型液相色譜進(jìn)樣器;AE240型電子天平(瑞士Mettler公司);AS10200型超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。丹參素鈉對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為110855－200809);抑毒調(diào)肝合劑(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院自制，批號為101004，101027，101105);甲醇為色譜純，水為濾過的蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:Hypersil C18柱(250 mm ×4.6 mm，5μm);流動(dòng)相:乙腈 － 甲醇 －水 －冰醋酸(0.5∶8∶92∶1);流速:1.0 mL/min;檢測波長:280 nm;柱溫:30℃;進(jìn)樣量20μL。理論塔板數(shù)以丹參素鈉計(jì)算不低于2 000。在此條件下，丹參素鈉色譜峰與相鄰干擾峰完全分離(見圖1)。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

稱取丹參素鈉對照品8.13 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得質(zhì)量濃度為0.813 g/L的丹參素鈉對照品溶液。精密量取抑毒調(diào)肝合劑100μL，置10 mL離心管，吹干，精密加入甲醇100μL，振蕩，離心，即得供試品溶液。取不含丹參的方中各藥料，按抑毒調(diào)肝合劑生產(chǎn)工藝制備丹參素鈉陰性對照樣品，取適量，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:精密吸取丹參素鈉對照品溶液2，4，6，8，10 mL，分別置50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度依次為 32.52，65.04，97.56，130.08，162.60 μg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，搖勻，按上述色譜條件分別進(jìn)樣20μL，測定峰面積。以峰面積(A)為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程 A=0.261 1C+1.816，r=0.991 4(n=5)。結(jié)果表明，丹參素鈉質(zhì)量濃度在 32.52～162.60μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn):精密吸取同一質(zhì)量濃度的對照品溶液(97.56μg/mL)20μL，按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果的 RSD為0.97%(n=6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液，在室溫條件下分別于0，2，4，6，8，10，12 h 時(shí)進(jìn)樣 20 μL，記錄峰面積。結(jié)果的 RSD 為1.43%(n=7)，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn):取同一批(批號為101004)樣品適量，共6份，依法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果丹參素鈉的平均含量為 91.63 μg/mL，RSD 為 1.12%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn):精密量取已知含量的樣品適量，置試管中，再分別精密加入低、中、高不同質(zhì)量濃度的丹參素鈉對照品溶液，按供試品溶液制備方法制備溶液并依法進(jìn)樣測定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 丹參素鈉加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.4 樣品含量測定

取樣品3支，混勻，精密量取，依法制備供試品溶液，按擬訂的色譜條件測定含量。結(jié)果批號為101004，101027，101105的樣品中丹參素鈉含量分別為 91.62，91.59，91.63 μg/mL(n=3)。

3 討論

丹參是唇形科植物丹參的干燥根莖，為2010年版《中國藥典(一部)》收載的常用中藥之一，味苦，性微寒，入心、肝經(jīng)，具有活血化瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰之功，為方中主藥。其化學(xué)成分分為脂溶性成分和水溶性成分，其中水溶性部分丹參素鈉已被證實(shí)具有明顯抑制肝癌細(xì)胞生長、阻止肝細(xì)胞硫代乙酰胺損傷和促進(jìn)肝細(xì)胞增生等作用[1－2]。因此本研究中將丹參素鈉作為抑毒調(diào)肝合劑含量測定的指標(biāo)性成分之一。

取丹參素鈉對照品溶液，在200～400 nm波長范圍進(jìn)行紫外掃描，發(fā)現(xiàn)在280 nm波長處有最大吸收，故選其為檢測波長。在試驗(yàn)過程中，比較了不同體系和不同比例的流動(dòng)相對主峰的保留時(shí)間、峰形和分離度的影響，結(jié)果以乙腈－甲醇－水－冰醋酸(0.5∶8∶92∶1)的分離效果最好，故選其作為流動(dòng)相。還發(fā)現(xiàn)柱溫對丹參素鈉分離測定影響較大，25℃時(shí)主峰的保留時(shí)間過長，柱溫過高其分離度不好，當(dāng)柱溫選擇30℃時(shí)結(jié)果滿意[3－4]。

采用反相高效液相色譜法測定制劑中丹參素鈉含量，方法學(xué)考察結(jié)果表明，方法精密度、穩(wěn)定性、加樣回收率和重復(fù)性均能滿足定量的要求。故該方法可用于抑毒調(diào)肝合劑的質(zhì)量控制，建議其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)升級時(shí)增加丹參素鈉的含量測定。

[1]吳映雅，譚宇蕙，寧異真，等.丹參素鈉對大鼠肝癌細(xì)胞及自殺基因旁觀者效應(yīng)的影響[J].中藥藥理與臨床，2007，23(5):52－54.

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[3]王 梅，楊 華.HPLC法測定防癱丸中丹參素鈉的含量[J].中醫(yī)研究，2010，23(8):21－23.

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