無標(biāo)記納米金傳感顯色測(cè)定五氯苯酚

姚英華，李程程，蔡青云*

（1.湖南益陽龍州中學(xué)，湖南益陽431000）

（2.湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，化學(xué)生物傳感與計(jì)量學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙410082）

0 引言

五氯苯酚（PCP）作為樹木的防腐劑、殺蟲劑和除草劑曾廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)和工業(yè)[1～2]。PCP除了作為防腐劑、農(nóng)藥等在使用過程中進(jìn)入環(huán)境外，還可以通過工業(yè)廢水排放進(jìn)入到水環(huán)境中，另外還可以通過在自然環(huán)境條件下，由其他物質(zhì)的合成或降解生成。五氯苯酚性質(zhì)穩(wěn)定，在通常情況下不容易被氧化，也難水解[3]，在肝、腎以及脂肪組織中累積，富集率高，能抑制生物代謝過程中氧化磷酸化作用，干擾內(nèi)分泌、影響生殖發(fā)育以及導(dǎo)致動(dòng)物肺、肝、腎臟以及神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和致癌等[4]，對(duì)人類生命安全造成嚴(yán)重威脅。PCP及其代謝產(chǎn)物對(duì)人體或者動(dòng)物體的毒性和危害不管是在組織、器官等整體水平還是細(xì)胞水平和分子水平都是很明顯的[5]，但是其毒性的作用機(jī)制目前還有待進(jìn)一步闡明。由于其劇毒性，存在持久性，生物富集性等，PCP被美國環(huán)保局（EPA）列為優(yōu)先污染物，并且被國際癌癥研究協(xié)會(huì)列為第2B組環(huán)境致癌物質(zhì)[6]，列入持久性有機(jī)污染物 （Persistent Organic Pollutants，POPs）優(yōu)先候選名單。POPs是一類具有高毒性、難降解、生物可累積性等特點(diǎn)的有機(jī)化合物的總稱[7～8]。POPs可以通過多種環(huán)境介質(zhì)（大氣、水、生物體等）進(jìn)行長距離遷移，對(duì)人類健康和環(huán)境造成嚴(yán)重危害。開發(fā)檢測(cè)人體或者動(dòng)物體內(nèi)PCP含量的快速檢測(cè)方法具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。

對(duì)環(huán)境中五氯苯酚的檢測(cè)以氣相色譜法[9]，氣質(zhì)聯(lián)用法[10]，高效液相色譜法等[11]為主要手段。這些方法具有較高的準(zhǔn)確度和靈敏度，然而其復(fù)雜的樣品預(yù)處理過程以及昂貴笨重的儀器設(shè)備，制約了其在快速現(xiàn)場(chǎng)分析方面的應(yīng)用。發(fā)展PCP的快速分析技術(shù)具有現(xiàn)實(shí)意義。目前報(bào)道的快速分析方法主要有電化學(xué)分析法[12]，化學(xué)發(fā)光分析[13],基于半導(dǎo)體納米材料的光電免疫分析[14],光譜分析法[15]、免疫標(biāo)記分析法[16]等。這些方法主要采用一些新型的納米材料，如二氧化鈦納米管、金納米粒子、量子點(diǎn)等，作為傳感基質(zhì)或敏感原件，借助于納米材料的光、電、以及催化特性，實(shí)現(xiàn)在復(fù)雜環(huán)境本底中污染物的檢測(cè)。

該文提出了一種簡(jiǎn)單，快速，低成本檢測(cè)PCP的方法。該方法檢測(cè)PCP的線性范圍較寬，從 1 nmol/L 到 1 mmol/L，檢測(cè)限為 0.5 nmol/L。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

儀器：BECKMAN DU-800紫外-可見分光光度計(jì)；Synergy UV Millipore超純水儀：超聲儀；恒溫箱；Adventurer AR214型電子天平。

試劑：氯金酸購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 ，NaCl、 H202、Fe(NH4)2(S04)2、 Na2HP04、KH2P04、C6H5Na3O7·2H2O均購于天津化學(xué)試劑公司。以上試劑均為分析純。整個(gè)實(shí)驗(yàn)用水為美國Milli-Q系統(tǒng)制備的超純水。

DNA購自上海生物工程技術(shù)有限公司，采用ULTRA PAGE 方式純化，序列為 ssDNA（20 mer）：5’-TAGCTATGGAATTCCTCGTA-3’

1.2 納米金的合成

預(yù)處理：在制備金納米粒子前，所有的玻璃儀器均用王水（VHCl∶VHN03=3∶1）浸泡 2 h，再用超純水沖洗3次，然后置于干燥箱烘干備用；所有的溶液均使用超純水配制。

Au NPs合成方法目前有很多，該文的合成方法參照文獻(xiàn)[17]，具體過程如下：在裝有球形冷凝回流管的100mL三頸燒瓶中加入50mL 1 mmol/L HAuCl4溶液，攪拌加熱出現(xiàn)逆流時(shí)，快速加入5mL 38.8 mmol/L的檸檬酸鈉溶液，1 min內(nèi)溶液的顏色由黃色很快變?yōu)楹谏?，再逐漸變?yōu)樽仙?，最后變成酒紅色。繼續(xù)加熱并劇烈攪拌20 min后停止加熱，移去加熱裝置，繼續(xù)劇烈攪拌15min，然后停止攪拌，拆除裝置，自然冷卻至室溫，用4.5 pm膜過濾，置于4℃冰箱中備用。

1.3 五氯苯酚的顯色檢測(cè)

在 20 μL 1 mmol/L Fe(NH4)2(S04)2中,加入 5 μL 50 mmol/L的ssDNA，加入5 μL不同濃度的五氯苯酚溶液后，再加入 20 μL 0.1 mol/L H2O2混合，攪拌均勻，室溫下反應(yīng)1 h,取5 μL反應(yīng)液加入到100 μL Au NPs溶液中，室溫下孵育2 min，再迅速加入4 μL 1 mol/L NaCl溶液，攪拌混勻。觀察Au NPs溶液顏色變化，并采用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定最終反應(yīng)液的吸收光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 測(cè)定原理

所合成的金納米溶液的紫外-可見吸收光譜如圖1所示，在520 nm處有最大吸收峰，與文獻(xiàn)一致[17]，表明合成的Au NPs粒徑約為13 nm。該文實(shí)驗(yàn)過程中合成的Au NPs有較好的穩(wěn)定性，在溫度為4℃的冰箱內(nèi)可以保存半年的時(shí)間而不發(fā)生任何性質(zhì)的變化。

圖1 Au NPs(粒徑約13 nm)的紫外-可見吸收光譜圖Fig.1 The UV-vis spectrum of Au NPs(～13 nm in diameter)

研究表明Au NPs的聚沉變色通常是由于其穩(wěn)定性遭到破壞造成的，而影響Au NPs穩(wěn)定性的主要因素是其表面電荷的靜電作用。該文合成的Au NPs表面有一個(gè)雙電層，使得Au NPs在溶液穩(wěn)定存在。當(dāng)加入一定量鹽 （例如1 mol/L NaCl）后，由于溶液的離子強(qiáng)度增大，雙電層遭到破壞，使得Au NPs間排斥作用減弱，導(dǎo)致Au NPs聚集變色。研究發(fā)現(xiàn)，ssDNA和金納米粒子有較好的親和力，而ssDNA帶負(fù)電荷，二者的結(jié)合改變Au NPs表面的電荷結(jié)構(gòu)，從而改變金納米溶液的穩(wěn)定性。這種變化可以通過顏色改變表現(xiàn)出來。為了考察ssDNA對(duì)Au NPs的保護(hù)作用，將1 μL 50 mmol/L的 ssDNA加入到 100 μL的 Au NPs溶液中，室溫下孵育2 min，再迅速加入4 μL 1 mol/L NaCl溶液，攪拌混勻，觀察Au NPs溶液顏色變化，并測(cè)定反應(yīng)液的紫外-可見吸收光譜。同時(shí)做對(duì)比實(shí)驗(yàn)，在沒有ssDNA的Au NPs溶液中加入同樣濃度的NaCl，反應(yīng)相同時(shí)間。結(jié)果如圖2所示，含有ssDNA的Au NPs溶液在鹽的作用下沒有聚沉變藍(lán)，而不含ssDNA的Au NPs溶液在鹽的作用下聚沉變藍(lán)，說明ssDNA可以保護(hù)Au NPs溶液，在一定濃度的鹽作用下不發(fā)生聚集。

圖2 100 μL Au NPs在 4 μL 1 mol/L NaCl作用下的紫外-可見吸收光譜，（1）不含 ssDNA；(2)含 1 μL 50 mmol/L的ssDNA；插圖 為相應(yīng)的顯色圖Fig.2 The UV-vis spectrum of 100 μL Au NPs after addition of 4 μL 1 mol/L NaCl(1)without ssDNA and(2)with 1 μL 50 mmol/L ssDNA.Inset shows the corresponding photos

由羥基自由基 （·OH）引起的氧化損傷ssDNA的原理如下：由H2O2和Fe2+發(fā)生Fenton反應(yīng)所生成的·OH可以隨機(jī)地將DNA切成不同長度的核酸碎片甚至是單個(gè)堿基。為了證實(shí)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥基自由基對(duì)ssDNA的氧化損傷作用，在 20 μL 1 mmol/L Fe(NH4)2(S04)2中，加入 10 μL 50 mmol/L 的 ssDNA （20 mer）， 再加入20 μL 0.1 mol/L H2O2，攪拌均勻，室溫下反應(yīng) 30 min。 取出 5 μL 反應(yīng)液加入到 100 μL Au NPs溶液中，室溫下孵育2 min，再迅速加入4 μL 1 mol/L NaCl溶液，攪拌混勻。觀察Au NPs溶液顏色變化，并測(cè)定其紫外-可見吸收光譜。結(jié)果如圖3所示。從圖中4號(hào)線可以看出，被Fenton試劑處理過的ssDNA不能使金納米在鹽溶液中穩(wěn)定存在，鹽作用下溶液顏色由紅色變?yōu)樗{(lán)色，在500～750 nm處有吸收。為了證明Au NPs的吸收峰及顏色改變不是由溶液中其它因素引起的，而是由Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的·OH氧化損傷ssDNA破壞了其對(duì)金納米的保護(hù)功能引起的，做了相關(guān)的對(duì)照實(shí)驗(yàn)。在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，只加入Fe2+或H2O2，或者不加Fe2+也不加H2O2。結(jié)果表明，Au NPs溶液的顏色沒有發(fā)生任何改變，仍然呈紅色。只有同時(shí)加入Fe2+和H2O2處理過的ssDNA，才失去對(duì)Au NPs的保護(hù)作用，在鹽的作用下，Au NPs溶液由紅色變?yōu)樗{(lán)色。其吸收光譜中，除了在520 nm處的微弱特征吸收，另外在650 nm左右也出現(xiàn)了新的吸收峰，這是由于Au NPs的聚集所造成的。這種趨勢(shì)與Au NPs在鹽溶液中的吸收峰是一致的。對(duì)照實(shí)驗(yàn)證明加入量的H2O2或Fe2+本身對(duì)ssDNA沒有影響，從而也不影響Au NPs的穩(wěn)定性。

圖3 1 μL 50 mmol/L 的 ssDNA+100 μL Au NPs在4 μL 1 mol/L NaCl作用下的紫外-可見吸收光譜。（1）不含 Fe2+和 H2O2;（2）含 Fe2+，不含 H2O2;（3）不含 Fe2+,含H2O2;（4）含F(xiàn)e2++H2O2;插圖 為相應(yīng)的顯色圖Fig.3 The UV-vis spectrum of solution containing 1 μL 50 mmol/L ssDNA and 100 μL Au NPs after addition of 4 μL 1 mol/L NaCl(1)without Fe2+and H2O2,(2)containing Fe2+(3)containing H2O2,(4)containing Fe2+and H2O2,Inset shows the corresponding photos

自由基的清除劑能夠清除自由基或阻止自由基參與氧化反應(yīng)，而一些容易被氧化的物質(zhì)通?？梢猿洚?dāng)自由基的清除劑或者說抗氧化劑。它們可以消耗羥基自由基從而抑制羥基自由基對(duì)ssDNA的氧化損傷，從而保護(hù)DNA的性質(zhì)結(jié)構(gòu)完整。該文的待檢測(cè)物五氯苯酚，是持久性有機(jī)污染物的一種，由于其分子結(jié)構(gòu)的獨(dú)特性，可作為羥基自由基的清除劑。基于此，五氯苯酚可能具有保護(hù)ssDNA不被羥基自由基氧化損傷的能力，從而可保護(hù)金納米粒子在鹽溶液中穩(wěn)定存在。首先檢驗(yàn)了五氯苯酚與DNA有無直接作用。對(duì)照實(shí)驗(yàn)如下，在5 μL 50 mmol/L的ssDNA中，加入5 μL不同濃度的五氯苯酚溶液，攪拌均勻，室溫下反應(yīng)1 h，取2 μL反應(yīng)液加入到100 μL Au NPs溶液中，室溫下孵育2 min，再迅速加入4 μL 1 mol/L NaCl溶液，攪拌混勻。觀察Au NPs溶液顏色變化，并測(cè)定紫外-可見吸收光譜。結(jié)果如圖4所示，隨著加入的PCP濃度的變化，金納米的狀態(tài)沒有明顯變化，最大吸收峰都在520 nm左右，說明PCP和Au NPs之間沒有反應(yīng)。

圖4 10 μL不同濃度PCP（從1到3濃度分別為0,3 nmol/L,3 mmol/L）與 100 μL Au NPs溶液混合均勻，在室溫下孵育2h,加入4 μL 1 mol/L NaCl溶液后，最終溶液的紫外-可見光譜圖。插圖 為相應(yīng)溶液的顯色圖Fig.4 The UV-vis spectrum of solution containing 10 μL PCP at different concentrations(1-3 corresponds to 0,3 nmol/L,and 3 mmol/L,respectively)and 50 mmol/L ssDNA after incubating in room temperature for 2 h and then addition of 4 μL 1 mol/L NaCl.Inset shows the corresponding photos.

2.2 最佳DNA含量的確定

分別在裝有100 μL Au NPs中加入不同濃度的1 μL ssDNA，攪拌均勻，2 min后，分別加入 4 μL 1 mol/L氯化鈉溶液，用相機(jī)拍下顏色，如圖5。在NaCl的量一定的情況下，ssDNA太少了不能起到保護(hù)Au NPs不被鹽聚沉的作用；太多了浪費(fèi)試劑。采用1 μL的ssDNA,當(dāng)其濃度小于50 μmol/L 時(shí)，金納米溶膠在加入 4 μL 1 mol/L 氯化鈉溶液的情況下發(fā)生明顯的聚沉。綜合考慮，該體系選擇加入 1 μL 50 μmol/L的 DNA。

圖5 加入1 μL不同濃度的ssDNA于100 μL Au NPs中，再加入4 μL 1 mol/L NaCl作用后的顏色對(duì)比圖Fig.5 The photos of 100 μL Au NPs containing 1 μL ssDNA at different concentrations after addition of 4 μL 1 mol/L NaCl

2.3 五氯苯酚的無標(biāo)記顯色檢測(cè)

前面的結(jié)果證實(shí)了五氯苯酚作為一種羥基自由基的消除劑，可以保護(hù)ssDNA不被羥基自由基損傷破壞，從而在Fenton試劑存在下，ssDNA仍然可以保護(hù)Au NPs在鹽的作用下不聚集。Au NPs的聚集可產(chǎn)生肉眼可見的顏色變化。在穩(wěn)定狀態(tài)下，呈紅色；發(fā)生聚集時(shí)，呈藍(lán)色。五氯苯酚的無標(biāo)記納米金檢測(cè)基于此原理建立。

在 5 μL 50 mmol/L的 ssDNA 中， 加入 5 μL不同濃度的五氯苯酚溶液混合，攪拌均勻，室溫下反應(yīng) 1 h，取 2 μL反應(yīng)液加入到 100 μL Au NPs溶液中，室溫下孵育2 min，再迅速加入4 μL 1 mol/L NaCl溶液，攪拌混勻。結(jié)果顯示，五氯苯酚濃度越高，Au NPs越不容易變色。由于Au NPs聚集導(dǎo)致在520 nm處的吸收減弱，在650 nm處的吸收增強(qiáng)，因此采用兩處吸光度的比值（A650/A520）表征PCP的濃度。如圖6所示，A650/A520和PCP的濃度對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，線性范圍：1 nmol/L到1 mmol/L?；谌对胍粲?jì)算的檢測(cè)限為0.5 nmol/L。

3 結(jié)論

該文基于五氯苯酚對(duì)氧化損傷ssDNA的保護(hù)作用，和ssDNA對(duì)金納米粒子的保護(hù)作用，利用金納米粒子聚集時(shí)顏色變化，提出了一種無標(biāo)記納米金顯色檢測(cè)五氯苯酚的方法。方法線性范圍:1 nmol/L 到 1 mmol/L,檢測(cè)限:0.5 nmol/L。

圖6 五氯苯酚濃度（c）與吸光度比值的關(guān)系Fig.6 The calibration curve of PCP

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