卡培他濱聯(lián)合放療的抗瘤效應(yīng)研究

弋振營 邢月明 晉剛

(1.開封市第一人民醫(yī)院腫瘤科 河南開封 475000; 2.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院腫瘤1科 太原 030001)

放療是非小細(xì)胞肺癌的主要治療手段之一,但放射治療5年生存率低。本實驗探討卡培他濱聯(lián)合放療對小鼠Lewis肺癌的抑瘤效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

動物及模型:C57BL/6J近交系雄性小鼠48只,引自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心,許可證號:SCXK(京)2004-0001。鼠齡6周,體重18～22g。

卡培他濱片:規(guī)格500mg/片,批號:SH0075。上海羅氏制藥有限公司提供。

照射方法:采用北京大恒公司KB1800型醫(yī)用電子直線加速器,6MV-X線進(jìn)行照射,SSD為100cm,劑量率為3Gy/min。

1.2 分組及處理

移植瘤直徑達(dá)1cm左右時,隨機(jī)分為:4組,每組12只。(1)對照組,不做任何處理;(2)放療組,X射線照射腫瘤局部5Gy/次×4次,隔日進(jìn)行1次;(3)卡培他濱組,按60mg/(kg·d),每只小鼠每天灌胃200μL卡培他濱混懸液,連用10d;(4)卡培他濱+放療組,放療和卡培他濱用法用量同前。

1.3 療效觀察

每天觀察荷瘤鼠活動、毛色、進(jìn)食等情況。每2天用游標(biāo)卡尺測量并計算腫瘤體積:V=1/6AB2π(A＞B)[1]一次。(A:腫瘤的最大長徑;B:與A垂直的最大寬經(jīng)),觀察腫瘤的生長情況并繪制腫瘤生長曲線。

1.4 病理形態(tài)觀察

放療結(jié)束后5d,引頸脫臼處死小鼠,取腫瘤組織切片、HE染色,普通光鏡下(100倍)觀察腫瘤組織。

1.5 測定瘤組織微血管密度(MVD)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)陽性率:

圖1 移植瘤體積生長曲線

圖2 移植腫瘤組織內(nèi)MVD（免疫組化x200）

圖3 腫瘤組織內(nèi)VEGF表達(dá)陽性率（免疫組化x400）

CD34或VEGF抗體為Ⅰ抗,SABC法免疫組化染色,具體方法根據(jù)試劑盒說明書。MVD計數(shù)按Weidner[2]的評判標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。低倍鏡(x40)下選擇5個血管最多的“熱點(diǎn)”區(qū)域,在200倍視野下計數(shù),每例標(biāo)本計數(shù)5個視野,最后取平均值。VEGF表達(dá)陽性率:隨機(jī)選取5個腫瘤外周區(qū)域,計數(shù)高倍鏡(×400)下染色陽性的腫瘤細(xì)胞,陽性細(xì)胞數(shù)除以同一視野下腫瘤細(xì)胞總數(shù),求得腫瘤細(xì)胞VEGF表達(dá)陽性率(%)[3]。

1.6 統(tǒng)計分析

利用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示,治療前腫瘤體積指標(biāo)采用單因素方差分析,多個樣本間均數(shù)比較采用析因設(shè)計方差分析。P<0.05認(rèn)為差異有顯著性。

2 結(jié)果

(1)治療前各組腫瘤體積無差別(P>0.05)。隨著時間的延長,各組腫瘤的體積均逐漸變大。對照組小鼠的腫瘤生長曲線最陡,各治療組小鼠的腫瘤生長曲線變平緩,放療+卡培他濱組曲線最平緩,說明對腫瘤抑制作用最強(qiáng)(圖1)。

(2)實驗結(jié)束后,進(jìn)行移植瘤組織病理學(xué)檢查,移植瘤組織內(nèi)有壞死,鏡下均可見癌組織,癌細(xì)胞圓形或橢圓形,核大,核仁明顯,濃然,細(xì)胞大小不等,癌細(xì)胞被纖維組織分隔成大小不等的癌巢。①組癌細(xì)胞生長旺盛,壞死很少。②組內(nèi)可見大片狀壞死。

(3)腫瘤組織切片中,微血管多集中于腫瘤細(xì)胞浸潤的邊緣部位。CD34陽性染色主要位于細(xì)胞的胞漿、核膜上,為棕黃色或褐色顆粒(圖2)。

VEGF主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì),陽性染色的腫瘤細(xì)胞多位于浸潤邊緣,表現(xiàn)為胞漿內(nèi)均勻棕黃色細(xì)顆粒狀。血管內(nèi)皮細(xì)胞可呈弱陽性染色(圖3)。

析因設(shè)計方差分析結(jié)果:MVD的放療因素與卡培他濱因素主效應(yīng)均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001);VEGF放療因素與卡培他濱因素主效應(yīng)均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001);卡培他濱和放療聯(lián)合應(yīng)用組的MVD、VEGF均數(shù)最小,即放療與卡培他濱2種方法同時應(yīng)用,腫瘤組織的MVD值、VEGF表達(dá)陽性率最低。放療因素與卡培他濱組因素之間存在交互作用(P<0.001;P<0.05)。

3 討論

肺癌是臨床常見、病死率最高的惡性腫瘤之一,其中以非小細(xì)胞肺癌最常見。約80%肺癌病例需接受放療或放化療綜合治療。提高放射治療增益比是腫瘤放射治療的根本目標(biāo)[4]。腫瘤劑量越大,腫瘤控制率就越高,但同時,對正常的組織和細(xì)胞損傷也越大。因此放療劑量不能無限提高。

5-Fu可抑制DNA放射損傷的修復(fù)及使周期敏感細(xì)胞成分增加,從而產(chǎn)生良好的放療增敏作用。但由于5-Fu的嚴(yán)重粘膜反應(yīng)和用藥的復(fù)雜性,限制了其臨床應(yīng)用[5]?？ㄅ嗨麨I是5-FU的前體藥物,通過TP酶轉(zhuǎn)化為5-Fu而激活。TP酶在腫瘤組織中的濃度增高,如其在肺癌中的陽性率達(dá)63.8%[6],正常肺組織無表達(dá)。這種現(xiàn)象有利于發(fā)揮卡培他濱的放療增敏作用;同時有研究表明放療可增強(qiáng)人類腫瘤移植物中TP酶的表達(dá),從而間接增加腫瘤內(nèi)氟尿嘧啶的濃度,但對周圍正常組織無影響,即放療提高了卡培他濱本身對腫瘤組織的殺傷力。

Folkman[7]首先發(fā)現(xiàn)了新生血管對腫瘤生長的重要作用。此后,多數(shù)人充分肯定了MVD與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的密切關(guān)系。作為反映腫瘤血管生成的最有效的客觀指標(biāo),目前多用二維平面上即顯微鏡焦平面上微血管的數(shù)量定量微血管密度。VEGF是一種具有高度生物活性的功能性糖蛋白,最早在牛垂體的腺泡細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)并提取[8],是最強(qiáng)的一種促血管生成物質(zhì),對血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、基膜降解、內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管構(gòu)建的調(diào)控作用較強(qiáng),且特異性高[9]。目前,抗血管生成已迅速發(fā)展為重要的抗癌策略,并成為腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。研究顯示放療有明顯的抗腫瘤血管生成作用[10]。

本課題通過動物實驗對卡培他濱與放療協(xié)同作用進(jìn)行了初步探索。從實驗資料中可看出,卡培他濱加放療抑瘤作用最明顯,移植瘤組織內(nèi)新生血管的數(shù)量減少最明顯,而且血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)率在所有處理組中均最低。二者協(xié)同抗瘤的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。但由于樣本量較小,有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)語

卡培他濱聯(lián)合放療對C57BL/6J小鼠Lewis肺癌有協(xié)同抗瘤作用。

[1]姜揚(yáng)文,錢莉,蔣桂花,等.ber-abl基因疫苗對小鼠SP2/0/BCR-ABL移植瘤的影響[J].中國實驗血液學(xué)雜志,2006,14(4):800～803.

[2]Weidner N,Folkman J,Pozza F,et al.Tumor angiogenesis:a new significant and independent prognositic indicator in early strage breast carcinoma[J].Natl Cancer Inst,1992,84(24):1875～1887.

[3]Vermeulen PB,Gasparini G,Fox SB,et al.Quantification of angiogenesis in solid human tumors:An international consensus on the methodology and criteria of evaluation[J].Eur J Cancer,1996,32A:2474～2484.

[4]殷蔚伯,余子豪,徐國鎮(zhèn),等.腫瘤放射治療學(xué)[M].北京:中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社,2008:141.

[5]駱華春.鼻咽癌放射增敏藥物的臨床研究進(jìn)展[J].實用癌癥雜志,2010,25(4):430.

[6]姜麗娜,于世英,熊慧華,等.胸苷磷酸化酶在癌組織中表達(dá)的研究[J].中華腫瘤雜志,2004,26(5):297～299.

[7]Folkman J.What is the evidence that tumors are angigenesis depent[J].Journal of the National CancerInstitute,1990,82:4～6.

[8]Carmeliet P,Collen D.Molecular basis of angiogenesis.Role of VEGF and VE-cadherin[J].Ann NY Acad Sci,2000,902:249～264.

[9]趙利枝,楊日芳,汪海.內(nèi)皮細(xì)胞與血管形成[J].中國藥理學(xué)通報,2002,18(4):361～364.

[10]陳洪雷,張苗,王雅杰.放療對荷瘤鼠腫瘤血管生成的抑制作用[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)2006,14(12):1494.