鹿油的超臨界二氧化碳萃取工藝及分析

劉俊渤，王 麗，胡耀輝，朱玉婷，于寒松

(1吉林農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，吉林長春130118;2吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，吉林長春130118)

鹿是一種珍貴的、具有藥用作用的特種經(jīng)濟動物.隨著我國鹿業(yè)市場的拓展和逐步成熟，每年都有大量鹿油得不到充分利用.鹿油富含飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸等多種功能性營養(yǎng)物質，其作為藥物使用早在《唐本草》與《中國醫(yī)學大辭典》就有記載.1999年朱秋勁等［1］對鹿油脂肪酸成分進行了分析.目前關于鹿油的提取、精煉及深加工技術等方面的相關研究很少，因此鹿油的研究前景廣闊.

目前動物油提取的方法有直接熬制法、蒸煮法、溶劑法、酶解法、超臨界流體萃取法等.隨著人們對綠色產(chǎn)品的不斷追求，超臨界流體萃取技術越來越受到研究學者的關注［2］.超臨界流體尤其是超臨界CO2萃取技術，具有工藝簡單、操作方便、無污染、低溫操作及抗氧化滅菌［3-6］等特點，它克服了傳統(tǒng)提取法易氧化酸敗、溶劑殘留等問題，尤其對熱敏性及易揮發(fā)生物功能性物質具有良好的保護作用，從而保證了鹿油的品質與功能，這對鹿油在醫(yī)藥保健品、化妝品、環(huán)保［7-8］、食品［9］、化工［10］等領域中的應用有著重要意義.但是超臨界CO2萃取也存在時間長、產(chǎn)率低等問題，因此，本研究以鹿肉為原料，采用正交試驗，通過控制萃取溫度、壓力、時間因素，探討了超臨界CO2萃取鹿油的最佳工藝，同時對超臨界萃取的鹿油進行脂肪酸組成及基本理化性質的分析，旨在為鹿油生產(chǎn)應用提供理論支持，同時也為鹿油開發(fā)提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

梅花鹿肉，由吉林農(nóng)業(yè)大學梅花鹿養(yǎng)殖場提供.

CO2(φ＞99.5%)，長春市氧氣廠;乙醇(φ＞99.7%)、乙醚(φ＞99.5%)、碘化鉀，國藥集團化學試劑有限公司;氫氧化鉀、硫代硫酸鈉，天津市化學試劑三廠;冰醋酸(φ＞99.5%)、鹽酸、硫酸、四氯化碳，北京化工廠.

Spe-ed Sfe-2/4超臨界CO2萃取儀，美國Applied Separations;DZF-6020真空干燥箱，上海-恒科學儀器有限公司;KQ5200DE超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;GC-MS氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(5975)，Agilent公司.

1.2 方法

1.2.1 原料預處理 將新鮮的鹿肉清洗除雜、冷凍粉碎，在相對真空度0.09 MPa、溫度90℃條件下干燥2 min后降溫至40～50℃下干燥，使鹿肉含水質量分數(shù)為0.06% ～0.08%，干燥后在40 kHz、40℃下超聲20 min，備用.

1.2.2 工藝流程與操作流程 鹿肉→除雜粉碎→干燥脫水→超聲→裝料→萃取→鹿油.

稱取15.00 g預處理后的鹿肉原料裝入反應釜，加蓋擰緊，裝入反應器中，升溫、加壓，調CO2流量至400 mL/min，萃取一定時間后收集鹿油.鹿油萃取率計算公式:鹿油萃取率 =鹿油質量/鹿肉質量 ×100%.

1.2.3 單因素試驗 萃取壓力的優(yōu)化:稱取15.00 g預處理后的鹿肉原料，以鹿油萃取率為評價指標，萃取溫度40℃、萃取時間90 min，萃取壓力分別為15、20、25、30、35、40 和 45 MPa，采用超臨界 CO2萃取鹿油，研究萃取壓力對鹿油萃取率的影響.

萃取溫度的優(yōu)化:稱取15.00 g預處理后的鹿肉原料，以鹿油萃取率為評價指標，萃取時間90 min，萃取壓力35 MPa，萃取溫度分別為30、35、40、45、50、55和60℃，采用超臨界CO2萃取鹿油，研究萃取溫度對鹿油萃取率的影響.

萃取時間的優(yōu)化:稱取15.00 g預處理后的鹿肉原料，以鹿油萃取率為評價指標，萃取溫度40℃，萃取壓力35 MPa，萃取時間分別為30、60、90、120、150、180和210 min，采用超臨界CO2萃取鹿油，研究萃取時間對鹿油萃取率的影響.

1.2.4 正交試驗 影響超臨界CO2萃取的因素很多［11-15］，其中，萃取壓力(p萃取)、萃取溫度(θ萃取)和萃取時間(t萃取)是影響超臨界流體萃取率的重要因素.在單因素試驗基礎上篩選出萃取壓力、萃取溫度、萃取時間的影響水平，進行L9(34)試驗設計(表1)，以萃取率為指標，進行正交試驗.進料量15.00 g，CO2流量400 mL/min.

表1 L9(34)正交試驗因素水平表Tab.1 L9(34)Orthogonal experiment factors and levels

1.2.5 鹿油理化指標測定［16］肉眼觀察色澤;參考GB/T 5532—85測定碘價;參考 GB/T 5534—85測定皂化值;參照GB/T 5530—85測定酸價.

1.2.6 鹿油脂肪酸成分分析 將最優(yōu)萃取條件下得到的鹿油樣品采用GC-MS氣相色譜-質譜聯(lián)用儀進行脂肪酸成分分析.氣相色譜-質譜條件:玻璃毛細管柱(60.00 mm×0.25 mm×0.25 μm);程序升溫條件:起始溫度100℃，然后以10℃/min的速度升至230℃，恒溫40 min;進樣口溫度:250℃;載氣:高純氦氣，流速為1 mL/min，分流體積比10∶1;接口溫度:250℃;電離方式:EI;電子能量:70 eV，離子溫度230℃，四極桿溫度150℃;調諧方式:標準調諧;質量掃描方式:SCAN;溶劑延遲:3 min;掃描質量范圍:10～550 amu;電子倍增器電壓:1.635 V.

1.3 鹿油樣品分析

準確稱取鹿油樣品0.100 0～0.200 0 g，加異辛烷溶解定容至10.0 mL，混勻，用微量注射器吸取50 μL于10 mL刻度試管中，加入0.4 mol/L KOH-甲醇溶液2.0 mL，置漩渦混合器2 min，室溫放置10 min.再加入異辛烷1.95 mL，再置旋渦混合器2 min，加80 g/L NaCl溶液至10 mL刻度，以2 000 r/min離心10 min，吸出上清液(異辛烷層)于2 mL小試管中，在上述GC/MS分析條件下，進樣1μL，以峰保留時間及譜庫檢索定性，與相應標準峰面積比較定量.

2 結果與分析

2.1 超臨界萃取條件單因素試驗

2.1.1 萃取壓力對鹿油萃取率的影響 由圖1a可

知，隨著萃取壓力升高，鹿油提取率也隨著逐步增大.當萃取壓力從15 MPa升到35 MPa時，鹿油提取率增大顯著;當萃取壓力超過35 MPa后，鹿油萃取率的增加變得緩慢，但仍呈現(xiàn)持續(xù)增加的狀態(tài).壓力對萃取率的影響比較顯著，壓力增大可增加CO2的密度，使分子間平均自由程減小，有利于擴散與滲透，進而提高了超臨界CO2對鹿油的萃取率.但當壓力增大到一定程度后，由于壓力改變對溶質的溶解度影響很小，因此萃取率無明顯提高，且從能源、經(jīng)濟等綜合因素考慮，鹿油萃取壓力以30～40 MPa為宜.

2.1.2 萃取溫度對鹿油萃取率的影響 由圖1b可知，在萃取壓力35 MPa，萃取時間90 min條件下，隨著溫度的升高，鹿油萃取率增大明顯，當萃取溫度超過40℃后，其萃取率增大緩慢，而當溫度超過50℃后，鹿油萃取率反而出現(xiàn)下降趨勢.這是因為溫度對鹿油提取率的影響十分復雜，在一定的壓力下，升高溫度，可降低超臨界CO2流體的運動黏度，提高系統(tǒng)中流體分子的熱運動速率，增大分子的擴散能力，從而使溶質的溶解度增加，有利于鹿油的浸出.但升高溫度的同時，超臨界CO2的密度降低，不利于溶質在流體中溶解，反而使鹿油萃取率降低，并且溫度過高，儀器設備的使用壽命也會受到影響，綜合因素考慮，鹿油萃取溫度以40～50℃為宜.

2.1.3 萃取時間對鹿油萃取率的影響 萃取時間對超臨界CO2萃取鹿油有顯著影響.超臨界萃取屬于擴散過程，需要一定時間才能萃取充分.萃取初期，由于溶劑的擴散速率緩慢，萃取率較低，隨著時間的延長，溶劑擴散能力增強，萃取率增大.從圖1c可知，在萃取溫度40℃、萃取壓力35 MPa條件下，萃取時間越長鹿油萃取率越高.在30～120 min時間內，鹿油萃取率隨著萃取時間的增加而顯著提高，但120 min后，隨著萃取時間的增加鹿油萃取率基本趨于平緩，因此鹿油萃取時間以120～180 min為宜.

圖1 萃取條件對鹿油得率的影響Fig.1 Effects of extraction conditions on the yield of deer oil

2.2 正交試驗結果

在單因素試驗的基礎上，采用三因素三水平的的正交設計方案，在9種不同工藝條件下萃取鹿油，分別測定其萃取率，結果見表2.表2的極差分析結果表明，超臨界萃取3個因素對鹿油萃取率的影響順序為:萃取溫度＞萃取壓力＞萃取時間，鹿油的最佳萃取方案為A2B3C2，即最佳萃取工藝條件組合為萃取溫度45℃，萃取壓力40 MPa，萃取時間150 min.

2.3 最佳萃取條件驗證

在上述最佳條件下(萃取溫度45℃、萃取壓力40 MPa、萃取時間150 min)進行3次重復試驗，其鹿油萃取率分別為32.22%、32.28%和32.25%，由萃取率可看出，最佳萃取工藝條件具有較好的重復性，鹿油萃取率較高，說明該工藝條件是合理的、可靠的.

表2 正交試驗結果Tab.2 Orthogonal experiment results

2.4 鹿油理化指標分析

對在萃取溫度45℃、萃取壓力40 MPa、萃取時間150 min條件下萃取所得鹿油進行理化性質分析，結果表明，超臨界萃取的鹿油呈純白色固體絮狀，質量濃度為0.907 g/mL，碘值為37.55，酸價為1.08 mg/g，皂化值為178.5 mmol/g.碘值、酸價和皂化值都是檢測油脂品質的基本理化指標，碘值是衡量鹿油不飽和酸含量的指標，酸值是衡量鹿油游離脂肪酸含量的指標，皂化值則是衡量鹿油脂肪酸相對分子質量大小的指標.超臨界萃取的鹿油酸價為1.08 mg/g，說明超臨界CO2萃取的鹿油游離脂肪酸較少，酸敗程度較低，具有良好的應用前景.

2.5 鹿油脂肪酸組成含量檢測分析

將超臨界CO2最佳萃取工藝條件下所得鹿油直接甲酯化，得鹿油脂肪酸甲酯色譜圖(圖2).采用面積歸一法計算其質量分數(shù)，結果見表3.由表3可知，鹿油含有多種飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸，不飽和脂肪酸質量分數(shù)達到41.94%，其中油酸(十八碳烯酸)和亞油酸(十八碳二烯酸)質量分數(shù)相對較高，油酸具有極佳的滲透性，不僅能夠降低膽固醇、防止大腦衰弱，同時能夠保護皮膚，防止皮膚損傷和衰老，保持皮膚光滑細膩，也可作潤滑劑，減少制品變形，增加表面光潔度，在化妝品和塑料行業(yè)中廣泛應用;亞油酸具有滋潤護膚的作用，還具有抗癌作用，同時能夠提高人體免疫力，減少人體脂肪沉積，有良好的減肥功效.飽和脂肪酸中以棕櫚酸(十六烷酸)和硬脂酸(十八烷酸)含量最高，棕櫚酸是制作肥皂的良好原料之一，硬脂酸和棕櫚酸都可以用來做乳化劑，使得到的膏體穩(wěn)定潔白.因此，鹿油將在醫(yī)藥保健品、化妝品等行業(yè)中具有廣闊的應用前景.

圖2 鹿油脂肪酸甲酯色譜圖Fig.2 Fatty acid methyl esters chromatogram of deer oil

表3 鹿油中各脂肪酸成分與含量Tab.3 Chemical compositions and contents of fatty acids in deer oil

3 結論

通過單因素試驗與正交試驗，確定了超臨界CO2萃取鹿油的最佳工藝條件為萃取溫度45℃、萃取壓力40 MPa、萃取時間150 min.萃取的鹿油為純白色，無雜質，富含多種飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸，其碘值為37.55，酸價為1.08 mg/g，皂化值為178.5 mmol/g.本研究不僅為超臨界CO2萃取技術在動物油脂提取中的進一步應用提供了可靠依據(jù)，也為鹿油的深層次開發(fā)奠定了基礎.

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