檢測犬源狂犬病毒中和抗體ELISA方法的建立

傅秋玲，鄭佳琳，林穎儀，張 瑩，陽佑天，潘姣姣，吳曉薇，郭霄峰

(華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣東廣州510642)

狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus，RV)引起的一種烈性人畜共患傳染病，病死率幾乎高達100%［1］.犬和貓是我國人狂犬病的主要傳染源，近年來，居民養(yǎng)犬數(shù)量不斷增多，為了有效地預防和控制狂犬病，研發(fā)一種適合我國國情且又能準確快速地檢測出狂犬病毒中和抗體的檢測方法具有重要的意義［2］.

目前，檢測狂犬病免疫效果的國際通用方法主要包括 WHO推薦方法——快速熒光灶抑制試驗(RFFIT)［3］和 OIE 推薦方法——熒光抗體病毒中和試驗(FAVN)［4］，這2種方法都具有特異性強、敏感性高且測出抗體效價即為中和抗體效價的優(yōu)點.但這2種方法都需要活病毒和培養(yǎng)細胞，均存在檢測時間長、對實驗室條件要求高、操作技能要求高、操作繁瑣及需要單份樣品量多等缺點，鑒于此，ELISA檢測法具有特異性好、敏感性高、快速便捷、廉價、可高通量檢測等優(yōu)點.因此構建不同的ELISA法倍受學者的親睞.1978年，Atanasiu等［5］首次利用ELISA方法檢測了狂犬病毒抗體，20世紀80年代，國外有許多學者成功建立了多種間接ELISA法檢測人的狂犬病毒抗體水平［6-7］.1988 年，Barton 等［8］首次利用間接ELISA方法檢測犬源狂犬病毒血清.在此基礎上，Mebastsion 等［9］和 Cliquet等［10］建立以酶標 SPA作為二抗的間接ELISA方法，這樣就可以檢測人和各種動物的 RV抗體水平.且周志軍等［11］建立的ELISA法已成為檢測不同種屬RV抗體水平的商品化試劑盒，但其價格昂貴.國內目前廣泛使用的ELISA法是以純化的狂犬病毒、P蛋白或N蛋白作為檢測抗原，其所測定的抗體效價并不代表具有保護效力的中和抗體水平［12-14］.為了解決國內缺少一種簡捷快速檢測狂犬病毒中和抗體的問題，本試驗以原核表達的狂犬病毒糖蛋白抗原優(yōu)勢表位區(qū)G3蛋白作為包被抗原建立了一種快速檢測狂犬病毒中和抗體的ELISA方法，以期達到安全、有效地檢測樣品中的RV中和抗體效價.

1 材料與方法

1.1 材料

犬RV標準陽性血清和陰性血清由華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院微生物與免疫學教研室制備保存，重組質粒pET32a-RVG3、BL21菌株由華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院微生物與免疫學教研室保存，HRP標記的羊抗犬IgG為Santa Cruz公司產品，蛋白純化HisTrap FF柱子為GE公司產品，可拆或不可拆酶標板為Castar公司產品，多功能酶標儀為Bio-Tec公司產品.其他試劑均為分析純.

1.2 重組蛋白的表達及純化

重組質粒pET32a-RVG3轉化BL21感受態(tài)細胞16 h后，挑取多個單菌落于含Amp+(100 μg/mL)LB液體培養(yǎng)基中，37℃條件過夜培養(yǎng).取上述培養(yǎng)菌按體積比1∶100比例接種于新鮮的含Amp+(100 μg/mL)2×YT培養(yǎng)液，優(yōu)化的誘導條件按文獻［15］，SDS-PAGE檢測重組蛋白表達情況.將表達量最高的重組BL21菌轉接于400 mL三角錐瓶中，進行大量誘導表達.收集菌體，超聲破碎后，經HisTrap FF純化，重組蛋白于-80℃條件保存?zhèn)溆?SDSPAGE檢測及Western-blot鑒定，紫外分光光度計測定蛋白濃度.

1.3 以G蛋白作為包被抗原建立檢測RV中和抗體的間接ELISA方法

1.3.1 抗原包被質量濃度與血清稀釋度的摸索

將純化的RV G3重組蛋白作為包被抗原，用包被液(0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液，pH 9.6)將診斷抗原稀釋成 16.0、10.0、8.0、6.0、4.0、2.0、1.0、0.5 mg/L，每孔加入100 μL，血清從1∶50、1∶100 稀釋到 1∶200，組成方陣，進行間接ELISA，分光光度計測定D450nm值，陽性血清的 D450nm/陰性血清的 D450nm(記為DP/DN)最大時的抗原包被質量濃度和抗體稀釋度為最佳的工作濃度.

1.3.2 酶標二抗工作濃度的優(yōu)化 采用直接ELISA法，血清按最佳稀釋度包被酶標板，4℃條件過夜，每孔100 μL;將 HRP標記的羊抗犬 IgG稀釋成1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000、1∶6 000、1∶8 000后，每孔100 μL，37 ℃孵育1.5 h.

1.3.3 酶標二抗最佳作用時間的確定 在優(yōu)化酶標二抗稀釋度后，于37℃條件下分別作用30、40、60、90、120 min，用 RV 陽性血清、陰性血清進行檢測，測定D450nm值，并分析DP/DN變化情況.

1.3.4 最佳封閉劑的確定 分別選用體積分數(shù)為10%的胎牛血清、1 kg/L的BSA、10 kg/L的脫脂奶粉、1 kg/L的明膠作為封閉劑，每孔250 μL，37℃條件封閉1.5 h.每份血清重復2孔，且將不加封閉劑作為對照孔.測定D450nm值，并分析DP/DN變化情況.

1.3.5 血清最佳孵育時間的確定 每孔加入100 μL最佳稀釋度的血清，37℃條件分別孵育30、60、90、120 min，其他條件按以上確定的最優(yōu)條件進行ELISA檢測，根據(jù)結果確定最佳條件.

1.3.6 最佳顯色時間的確定 按上述已確定的最優(yōu)條件進行ELISA檢測，每孔加入100 μL TMB單組分顯色液，在室溫黑暗條件下顯色 5、10、15、20、25 min，其他條件按上述已優(yōu)化的最佳條件，根據(jù)結果確定最佳時間.

1.3.7 批內重復性試驗 用同一批制備的重組抗原包被的酶標板，隨機取5份血清，每份血清做6孔重復，在同一時間同一條件下按照間接ELISA的程序進行檢測，結果用統(tǒng)計學方法分析.

1.3.8 批間重復性試驗 用同一批制備的重組蛋白包被酶標板，取5份抗體水平不同的RV血清，在4個不同時間按間接ELISA程序測定，每份血清做2個重復，結果進行統(tǒng)計學分析.

1.3.9 臨界值及陰陽性標準的確定 取30份犬RV陰性血清按照已建立的間接ELISA方法進行檢測，計算出陰性D450nm值的算術平均值(和標準差(S)，從而確定臨界值上限值(+3 S)和臨界值下限值2 S).

1.3.10 敏感性試驗 將RV血清作梯度稀釋，ELISA方法進行檢測，測定陽性檢出的最大血清稀釋度即為該檢測方法的敏感性.

1.3.11 特異性試驗 以犬RV陽性血清和陰性血清為對照，用已建立的間接ELISA檢測犬細小病毒、犬瘟熱病毒、犬腺病毒-1型的陽性血清，分析此方法的特異性.

1.3.12 臨床樣本檢測 用已構建的ELISA方法與美國SYNBIOTICS狂犬病抗體檢測試劑盒檢測狂犬病疫苗免疫后不同時期的農村家犬血清樣品134份進行比較，比較2次檢測結果，以驗證該方法的可靠性.

2 結果與分析

2.1 重組蛋白的表達及純化

重組蛋白包涵體用8 mol/L尿素溶解和超聲破碎，經HisTrap FF純化后，進行SDS-PAGE電泳(圖1)和Western-blot鑒定(圖2).免疫印跡檢測結果表明，重組蛋白能與OIE標準陽性血清發(fā)生特異性反應，說明重組蛋白有特異性反應，且成功地在原核系統(tǒng)里獲得了正確的表達，具有良好的血清學反應活性.

圖1 重組蛋白表達的SDS-PAGE分析Fig.1 Analysis of the recombinant expression by SDS-PAGE

圖2 重組蛋白的Western-blot結果Fig.2 The result of Western-blot

2.2 間接ELISA方法的建立

2.2.1 最佳抗原包被質量濃度和最佳血清稀釋度的確定 通過棋盤法確定了最佳抗原包被質量濃度和最佳血清稀釋度，結果見表1.由表1可知，抗原的最佳包被質量濃度為8.0 mg/L，血清的最佳稀釋度為1∶100，此時的 D450nm接近1.0，且 DP/DN最大.

表1 最佳抗原包被質量濃度和最佳血清稀釋度的檢測結果Tab.1 Optimization for concentration of antigen and dilution of serum with indirect ELISA

2.2.2 酶標二抗工作濃度的優(yōu)化 在最佳抗原和血清稀釋度反應條件下，當酶標二抗的稀釋度為1∶3 000時，D450nm接近1.0，且 DP/DN相對最大，故確定酶標二抗的工作濃度為1∶3 000(表2).

表2 酶標抗體最佳工作濃度的優(yōu)化Tab.2 Optimization of optimal dilutions of enzyme labeled antibody

2.2.3 酶標二抗作用時間的摸索 由表3結果可知，當酶標二抗在37℃條件孵育60 min時，其DP/DN最大，故酶標二抗最佳作用時間為60 min.

2.2.4 最佳封閉劑的確定 體積分數(shù)為10%的胎牛血清、1 kg/L的BSA、10 kg/L的脫脂奶粉、1 kg/L的明膠作為封閉劑時的試驗，結果(表4)顯示，體積分數(shù)為10%的胎牛血清作為封閉劑時DP/DN最大，陽性血清D450nm在1.0左右.

表3 酶標抗體孵育時間的確定Tab.3 Determination of optimal incubation time of enzyme labeled antibody

表4 不同封閉劑的篩選Tab.4 Optimization of blocking solutions

2.2.5 血清孵育時間的確定 由表5中數(shù)據(jù)可知，隨著孵育時間的延長，陽性血清D450nm會增大，但其陰性的D450nm增加更快，故DP/DN反而降低，當37℃條件孵育30 min時，DP/DN最大(表5).

表5 血清最佳孵育時間的優(yōu)化Tab.5 Determination of optimal incubation time of serum

2.2.6 最佳顯色時間的確定 由表6可知，底物最佳作用條件為室溫避光條件下作用20 min后，用2 mol/L H2SO4終止反應，即刻讀數(shù).

表6 底物最佳顯色時間的確定Tab.6 Determination of reaction time of substrate

2.2.7 批內、批間重復性的評價 批內重復試驗結果見表7.結果顯示變異系數(shù)2.30% ～9.89%，小于10%，表明同一批抗原具有良好的穩(wěn)定性，此方法批內重復性良好.批間重復試驗結果(表7)表明，取5份血清在4個日期重復性試驗結果統(tǒng)計學分析，其變異系數(shù)在5.40% ～8.22%，小于10%，說明此方法具有較好的重復性和穩(wěn)定性.

表7 批內誤差和批間誤差試驗Tab.7 Intro-assay error and inter-assay test

2.2.8 臨界值及陰陽性標準的確定 將由華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院微生物與免疫學教研室制備的經FAVN試驗確定為狂犬病毒陰性血清的30份犬血清樣品按照已建立的間接ELISA方法進行檢測，計算出陰性D450nm的平均值 =0.097 4，S=0.059 5，置信區(qū)間0.216～0.276，根據(jù)間接 ELISA臨界值判定標準，D450nm≥0.276時判斷為陽性樣本，D450nm≤0.216時判斷為陰性樣本，介于兩者之間判定為可疑樣本，進行重新檢測.

2.2.9 特異性試驗 犬細小病毒陽性血清、犬瘟熱陽性血清和犬腺病毒-1型陽性血清檢測均為陰性，表明此方法具有良好的特異性.

2.2.10 敏感性試驗 對不同稀釋度的RV陽性血清進行ELISA檢測，稀釋度為1∶2 560時，其DP/DN＜2.1，其他的稀釋度的DP/DN＞2.1，因此其靈敏度為1∶1 280(表8).

表8 敏感性試驗Tab.8 The sensitivity of indirect ELISA

2.2.11 臨床樣品的檢測 用建立的間接ELISA方法檢測136份血清樣品，檢測結果顯示，有102份樣品為陽性，34份為陰性.而用SYNBIOTICS試劑盒檢測105份為陽性，31份為陰性，因此兩者的陽性符合率為97.1%，陰性符合率為91.2%，總符合率為95.6%.說明2種方法具有良好的相關性.

3 討論

狂犬病毒糖蛋白構成病毒粒子表面的棘狀突起，是唯一誘導產生中和抗體的蛋白，其免疫作用與全病毒疫苗相當.膜外區(qū)決定狂犬病糖蛋白的抗原性、毒力及組織親嗜性［15］.因此本試驗所用的檢測抗原即是原核表達系統(tǒng)表達的糖蛋白100～300AA區(qū)段抗原表位區(qū)(G3)，SDS-PAGE和免疫印跡試驗驗證了RV G3具有良好的免疫原性，可用于狂犬病的臨床診斷和基礎研究.

狂犬病是由狂犬病病毒引起的一種人獸共患的急性致死性中樞系統(tǒng)感染的傳染病，感染后潛伏期一般較長，簡單快速地檢測免疫動物的中和抗體水平顯得至關重要.中和抗體是判定免疫動物是否獲得抵抗野毒攻擊的重要標志［16］.因此檢測狂犬病毒抗體水平實質是檢測出中和抗體效力.盡管目前國內已建立了多種檢測狂犬病毒抗體的ELISA方法，而建立一種檢測中和抗體的ELISA方法還處于摸索階段.為了解決這個問題，本試驗以重組G蛋白為檢測抗原成功地建立了一種檢測犬狂犬病毒抗體的ELISA法.此重組糖蛋白利用原核表達系統(tǒng)誘導表達，并通過優(yōu)化密碼子大大提高了其原核表達的蛋白量［15］，這為構建ELISA法提供了足量的抗原物質.試驗結果表明:此ELISA法批內、批間的變異系數(shù)都小于10%，說明其穩(wěn)定性和重復性好，且敏感性高和特異性強(不與其他的犬源病毒血清反應).通過大量的臨床樣品檢測驗證了此ELISA法檢測結果與SYNBIOTICS試劑盒的結果具有一致的相關性(r=95.6%).本試驗建立的ELISA方法耗時短、操作簡便、廉價，特別適合大批量血清樣品的檢測，克服了傳統(tǒng)的中和試驗存在耗時長、易散毒、操作繁瑣和需要標準實驗等不足，將為犬源狂犬病毒中和抗體檢測提供簡便快捷的檢測方法.

［1］涂長春.我國狂犬病流行現(xiàn)狀及原因［J］.動物保健，2006(8):11-12.

［2］唐婕，李六金，陳鐵橋.狂犬病研究動態(tài)［J］.動物醫(yī)學進展，2006，27(7):100-104.

［3］SMITH J S，YAGER P A，BAER G M.A rapid reproducible test for determining rabies neutralizing antibody［J］.Bull World Health Organi，1973，48(5):535-541.

［4］CLIQUET F，AUBERT M，SAGNé L.Development of a fluorescent antibody virus neutralisation test(FAVN test)for the quantitation of rabies-neutralising antibody［J］.J Immunol Methods，1998，212(1):79-87.

［5］ATANASIU P，PERRIN P.Micromethod for rabies antibody detection by immunoenzymatic assay with staphylococcus protein A(author’s transl)［J］.Ann Microbiol，1979，130(2):257-268.

［6］NICHOLSON K G，PRESTAGE H.Enzyme-linked immunosorbent assay:a rapid reproducible test for the measurement of rabies antibody［J］.J Med Virol，1982，9(1):43-49.

［7］GRASSI M，WANDELER A I，PETERHANS E.Enzymelinked immunosorbent assay for determination of antibodies to the envelope glycoprotein of rabies virus［J］.J Clini Microbiol，1989，27(5):899-902.

［8］BARTON L D，CAMPBELL J B.Measurement of rabiesspecific antibodies in carnivores by an enzyme-linked immunosorbent assay［J］.J Wildl Dis，1988，24(2):246-258.

［9］MEBATSION T，F(xiàn)ROST J W，KRAUSS H.Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)using staphylococcal protein A for the measurement of rabies antibody in various species［J］.J Vet Medi:Series B，1989，36(7):532-536.

［10］CLIQUET F，SAGNé L，SCHEREFFER J L，et al.ELISA test for rabies antibody titration in orally vaccinated foxes sampled in the fields［J］.Vaccine，2000，18(28):3272-3279.

［11］周志軍，尹斌，朱華松，等.ELISA抗體檢測試劑盒在狂犬病毒特免血漿篩選中的初步應用［J］.微生物學免疫學進展，2005，33(2):45-48.

［12］楊文祥，徐國景，唐利軍，等.犬狂犬病毒抗體ELISA檢測方法的建立［J］.公共衛(wèi)生與預防醫(yī)學，2007，18(2):5-8.

［13］高明華，夏咸柱，薛琳.狂犬病毒N基因的原核表達及間接ELISA方法的建立［J］.中國人獸共患病學報，2007，23(1):31-34.

［14］趙剛，李剛，陳鐵橋，等.狂犬病病毒P基因的原核表達及間接ELISA方法的應用［J］.中國人獸共患病學報，2010，26(2):163-167.

［15］鄭佳琳，江飆，郭霄峰.優(yōu)化密碼子以提高狂犬病病毒糖蛋白基因在原核細胞的表達［J］.中國人獸共患病學報，2010，26(5):403-407.

［16］梁紅茹，劉曉慧，陳晶，等.狂犬病毒新型快速熒光斑點抑制實驗方法的建立［J］.中國人獸共患病學報，2009，25(7):619-622.