褐藻多糖硫酸酯對(duì)阿霉素腎硬化大鼠腎組織FN、TGF-β、MMP-9的影響*

陳雪風(fēng) 吳漢利

（山東省濰坊市益都中心醫(yī)院，山東 青州 262500）

慢性腎衰竭的病理基礎(chǔ)是細(xì)胞外基質(zhì)不適當(dāng)?shù)姆e聚［1］。已有部分臨床資料表明褐藻多糖硫酸酯（FPS）能延緩慢性腎衰竭的進(jìn)展［2］，但其作用機(jī)理尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立阿霉素腎硬化大鼠模型，觀察該藥對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠腎組織纖連蛋白（FN）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-9 的影響，以探討其對(duì)實(shí)驗(yàn)性腎小球硬化的防治作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)健康雌性SD大鼠40只，體質(zhì)量（190±10）g，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK－（軍）2011－004。 大鼠自由飲水（水為清潔自來(lái)水）、攝食，室內(nèi)溫度控制在20～24℃，實(shí)驗(yàn)室濕度55%～60%，保持環(huán)境安靜。

1.2 藥品及試劑 海昆腎喜膠囊：吉林省輝南長(zhǎng)龍生化藥業(yè)股份有限公司，每粒裝0.22 g（含褐藻多糖硫酸酯 100 mg），批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z20030052。鹽酸貝那普利：北京諾華制藥有限公司，10 mg/片，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z20030514。阿霉素：注射用鹽酸多柔比星（阿霉素）：深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)有限公司，10 mg/支，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H44024359。

1.3 模型制備 阿霉素腎病模型建立按Bertani等［3］法造模。適應(yīng)喂養(yǎng)兩周后，動(dòng)物稱(chēng)體質(zhì)量，固定，用酒精擦試尾部，使其尾靜脈充分暴露，以1毫升注射器配7號(hào)針頭，按照7 mg/kg體質(zhì)量，抽取阿霉素注入尾靜脈。如尾部無(wú)迂曲、腫脹則表示注射成功，正常組同法注射等量生理鹽水。

1.4 分組及給藥 成模大鼠隨機(jī)分為模型組、鹽酸貝那普利組、海昆腎喜組，每組10只。各組均自由飲水、攝食。大鼠用藥量按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》計(jì)算，約為人1d劑量的20倍。正常組、模型組每天灌胃等體積生理鹽水，鹽酸貝那普利組按0.4 mg/（100 g·d）灌胃鹽酸貝那普利，海昆腎喜組按20 mg/（100 g·d）灌胃海昆腎喜。實(shí)驗(yàn)結(jié)束模型組3只、鹽酸貝那普利組2只、海昆腎喜組1只大鼠因腹瀉、全身浮腫在造模2周內(nèi)死亡。模型組尿蛋白平均（187.50±12.14） g/L，共喂養(yǎng) 8 周。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 8周后大鼠放血處死，生理鹽水經(jīng)主動(dòng)脈灌注，取腹正中切口，暴露并切除腎臟。腎臟冠狀面取腎組織，甲醛固定石蠟包埋組織切片，厚度為2 μL，用于PAS染色、免疫組化。腎部分皮質(zhì)用于Western blot檢測(cè)。

1.5.1 腎臟系膜基質(zhì)指數(shù) 腎組織切片經(jīng)常規(guī)脫水、脫蠟后行PAS染色。光鏡下觀察腎小球及間質(zhì)小管的病變程度。每張切片在400倍目鏡下隨機(jī)取6個(gè)完整腎小球，應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)測(cè)定腎小球面積（G）與系膜基質(zhì)面積（M），計(jì)算系膜基質(zhì)指數(shù)（M/G），此值即為腎小球基質(zhì)相對(duì)面積。

1.5.2 腎臟組織纖維連接蛋白（FN）光密度 腎組織切片經(jīng)常規(guī)脫水、脫蠟后行免疫組化檢測(cè)。棕色或者棕褐色著色面積作為陽(yáng)性面積。應(yīng)用計(jì)算機(jī)醫(yī)學(xué)病理圖像分析系統(tǒng)對(duì)腎臟組織切片的免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果進(jìn)行分析，在200倍光學(xué)顯微鏡下每個(gè)組織切片采集10個(gè)不重疊視野中的陽(yáng)性染色面積，然后計(jì)算每個(gè)視野內(nèi)的染色區(qū)域的平均光密度數(shù)值，數(shù)據(jù)匯總后應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析。

1.5.3 TGF-β、MMP-9蛋白表達(dá) 用含蛋白酶抑制劑的組織裂解液（30 mmol/L Tris，pH 7.5，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L PMSF，1 mmol/L Na3VO4，1%Nonidet P-40，10%甘油） 在研磨器中研磨，離心取上清液即為總蛋白。每孔加75 μg總蛋白進(jìn)行8%SDS聚丙烯酞胺凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)儀濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜。5%脫脂奶室溫封閉60 min，加一抗于4℃過(guò)夜。然后加相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫反應(yīng)120 min，用ECL化學(xué)發(fā)光劑（美國(guó)Santa Cruz）在X光片上曝光，顯影、定影、沖洗晾干后掃描蛋白條帶。以β-actin為內(nèi)參，采用cymentre2000柯達(dá)活體成像儀進(jìn)行定量分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；兩變量間相關(guān)關(guān)系采用雙變量相關(guān)分析（Spearman相關(guān)系數(shù)）。

2 結(jié) 果

2.1 各組腎臟系膜基質(zhì)指數(shù) （腎小球基質(zhì)面積Ms/腎小球面積Gs）變化 見(jiàn)表1，圖1。與正常組相比，模型組、鹽酸貝那普利組、海昆腎喜組腎臟系膜基質(zhì)指數(shù)明顯升高（P＜0.05或0.01）；與模型組相比，鹽酸貝那普利組、海昆腎喜組腎臟系膜基質(zhì)指數(shù)明顯降低（P＜0.05或0.01）；海昆腎喜組腎臟系膜基質(zhì)指數(shù)明顯低于鹽酸貝那普利組（P＜0.05）。

2.2 各組大鼠腎臟組織纖維連接蛋白（FN）光密度積分比較見(jiàn)表1，圖2。與正常組相比，模型組、鹽酸貝那普利組、海昆腎喜組腎臟FN光密度明顯升高（P＜0.05或0.01）；與模型組相比，鹽酸貝那普利組、海昆腎喜組FN光密度明顯降低（P＜0.05或0.01）；海昆腎喜組腎臟FN光密度明顯低于鹽酸貝那普利組（P＜0.05）。

表1 各組腎臟系膜基質(zhì)指數(shù)、FN光密度積分比較（±s）

表1 各組腎臟系膜基質(zhì)指數(shù)、FN光密度積分比較（±s）

與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與鹽酸貝那普利組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。下同。

組 別 系膜基質(zhì)指數(shù) FN光密度積分正常組 0.35848±0.005 0.164±0.013模型組 0.63023±0.017** 0.466±0.037**鹽酸貝那普利組 0.52800±0.006**△ 0.249±0.027**△△海昆腎喜組 0.41637±0.012*△△▲ 0.207±0.009*△△▲

圖1 各組8周腎臟系膜基質(zhì)（PAS，×400）

圖2 8周腎臟FN光密度改變（×200）

2.3 各組 TGF-β、MMP-9 Western blot結(jié)果比較 見(jiàn)表2，圖3。模型組TGF-β蛋白表達(dá)增加、MMP-9蛋白表達(dá)下降，與正常組相比均有明顯差異（P均＜0.01）；與模型組相比，鹽酸貝那普利組和海昆腎喜組TGF-β表達(dá)下降、MMP-9表達(dá)上升 （P＜0.05或0.01）；海昆腎喜組TGF-β蛋白表達(dá)低于鹽酸貝那普利組（P＜0.05），而MMP-9蛋白表達(dá)海昆腎喜組高于鹽酸貝那普利組（P＜0.01）。

2.4 相關(guān)性分析 結(jié)果顯示 TGF-β 值與 FN （r=0.769，P＜0.01）、系膜基質(zhì)指數(shù)（r=0.856，P＜0.01）均呈正相關(guān)；MMP-9 值與 FN（r=-0.894，P＜0.01）、系膜基質(zhì)指數(shù)（r=-0.699，P＜0.01）均呈負(fù)相關(guān)。

表2 各組 TGF－β、MMP－9 蛋白表達(dá)比較（±s）

表2 各組 TGF－β、MMP－9 蛋白表達(dá)比較（±s）

組 別 TGF-β（TGF-β/β-actin） MMP-9（MMP-9/β-actin）正常組 0.263±0.015 0.416±0.015模型組 0.447±0.026** 0.2321±0.011**鹽酸貝那普利組 0.416±0.015**△ 0.327±0.019**△△海昆腎喜組 0.329±0.027△△▲ 0.394±0.021△△▲▲

圖3 8周腎臟 TGF-β、MMP-9 Western blot結(jié)果

3 討 論

阿霉素腎病模型（ADR）由 Bertani等［3］在 1982 年創(chuàng)建的，是研究人類(lèi)局灶階段性腎小球硬化的理想模型。模型組實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)出現(xiàn)大量蛋白尿，病理出現(xiàn)系膜基質(zhì)明顯增多，腎小球階段硬化，提示局灶階段性腎小球硬化模型造模成功。

FN是ECM的主要成分，其合成增多在腎臟纖維化早期即可出現(xiàn)明顯變化。FN的合成可為其他ECM的沉積和膠原的形成提供一個(gè)支架，同時(shí)促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞產(chǎn)生和分泌ECM增加［4］。因此FN可作為檢測(cè)腎臟纖維化的主要指標(biāo)之一。本研究發(fā)現(xiàn)FPS可明顯抑制系膜基質(zhì)的增生和FN的產(chǎn)生，與文獻(xiàn)［5］報(bào)道類(lèi)似。

腎小球內(nèi)系膜基質(zhì)積聚與細(xì)胞因子調(diào)控失衡引起的ECM合成增加和（或）降解減少密切相關(guān)［6］。TGF-β在細(xì)胞增殖及纖維化中具有重要作用，在促進(jìn)基質(zhì)沉積和組織硬化中是關(guān)鍵的細(xì)胞因子之一［7-8］。 另外，大量研究［9］證明，基質(zhì)降解蛋白酶活性受到抑制是引起基質(zhì)成分不斷積聚，從而導(dǎo)致腎小球硬化的另一重要機(jī)制。而TGF-β具有降低MMP活性并增加此酶抑制劑TIMP活性，從而使基質(zhì)降解減少［10-11］。本研究發(fā)現(xiàn)FPS可明顯降低TGF-β表達(dá)，與報(bào)道類(lèi)似［5］，同時(shí)提高M(jìn)MP表達(dá)，相關(guān)性分析研究顯示，TGF-β值與FN、系膜基質(zhì)指數(shù)呈正相關(guān)；MMP-9值與FN、系膜基質(zhì)指數(shù)呈負(fù)相關(guān)；提示海昆腎喜可能通過(guò)調(diào)控TGF-β及MMP-9表達(dá)，減輕FN沉積，從而抑制腎小球硬化，這為臨床應(yīng)用海昆腎喜治療慢性腎臟病提供了理論依據(jù)。

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