高效降解棉粕中游離棉酚菌種的篩選

劉建成 馬貴軍 蔣粒薪

棉籽粕（cottonseed meal,CSM）是棉籽經(jīng)脫殼、加熱、壓扁成薄片用溶劑浸出油后，所剩余的副產(chǎn)品。棉籽粕中含粗蛋白40%以上，還含有豐富的賴氨酸、蛋氨酸，是畜禽飼料中非常有價(jià)值的一種原料。我國(guó)是一個(gè)產(chǎn)棉大國(guó)，每年有1100萬(wàn)噸以上的棉籽，年可產(chǎn)棉籽餅粕600萬(wàn)噸以上，資源量全球第一。棉籽餅粕是一種極具開(kāi)發(fā)潛力的植物蛋白飼料資源，但是棉籽餅粕中含有有毒物質(zhì)游離棉酚，會(huì)對(duì)動(dòng)物的生產(chǎn)、發(fā)育和繁殖等方面產(chǎn)生不良影響，從而限制了棉籽餅粕安全而有效地用作動(dòng)物蛋白飼料，部分地區(qū)將其作肥料，造成飼料資源的嚴(yán)重浪費(fèi)。

棉籽餅粕的主要脫毒方法有物理法 (熱處理、機(jī)械壓榨、有機(jī)溶劑浸提)、化學(xué)法(硫酸亞鐵、氫氧化鈣)以及微生物發(fā)酵法。最具有應(yīng)用前景的是微生物發(fā)酵法，該法不但能脫除棉籽餅粕中的游離棉酚，而且還可以提高棉籽餅粕的蛋白質(zhì)含量，并且發(fā)酵底物中存留許多酶類、維生素、氨基酸以及一些促生長(zhǎng)因子，從而大大改善棉粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和飼用價(jià)值，提高棉粕利用率。

本研究嘗試從對(duì)動(dòng)物有益的酵母菌屬、芽孢桿菌屬及乳酸菌屬中篩選出能高效降解棉粕中游離棉酚的菌株，對(duì)棉粕進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵。降低棉粕中游離棉酚含量，并產(chǎn)生大量益生菌、乳酸、生長(zhǎng)因子，提高動(dòng)物免疫力，改善棉粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和飼用價(jià)值，提高棉粕利用率。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌種：芽孢桿菌屬2株：B－1、B－2。乳酸菌屬4株：L－1、L－2、L－3、L－4。酵母菌屬 4 株：Y－1、Y－2、Y－3、Y－4。以上菌株均購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保存中心（CICC）。

原料：棉粕購(gòu)自新疆新光油脂廠。

1.2 培養(yǎng)基

單菌培養(yǎng)基（g/l）：糖蜜 40、蛋白胨 10、葡萄糖 1、磷酸氫二鉀 0.5、硫酸鎂 0.2，pH值7.0～7.2，121℃高壓滅菌25 min。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基（g/kg）：棉籽粕 950、麩皮 45、天康酶制劑5、糖蜜10、水700。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 脫酚細(xì)菌菌株的初篩

以棉籽仁（含游離棉酚7012.98 mg/kg）作為培養(yǎng)基唯一營(yíng)養(yǎng)物，配制棉酚含量為200 mg/kg的初始篩選平板。將6株細(xì)菌的單菌培養(yǎng)液稀釋后涂于初始篩選平板上，在生化培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)觀察。

1.3.2 脫酚酵母菌菌株的初篩

以固體發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，配制棉酚含量為200 mg/kg的初始篩選培養(yǎng)基。按2%的接種量，將培養(yǎng)后的不同酵母菌液接種于滅菌后的初始篩選培養(yǎng)基中，充分混勻后于30℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)，測(cè)定發(fā)酵后培養(yǎng)基中菌含量。

1.3.3 滅菌條件下的固態(tài)發(fā)酵

將固體發(fā)酵培養(yǎng)基各成分充分混勻后，裝入100 g/500 ml在三角瓶中，于121℃高壓滅菌25 min。冷卻至室溫后，按2%的接種量，將培養(yǎng)后的單菌液稀釋10倍后接種，混勻后于30℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)發(fā)酵。

1.3.4 不滅菌條件下的固態(tài)發(fā)酵

按2%的接種量，先將菌種、糖蜜和水充分混勻，再與混勻后的固體發(fā)酵培養(yǎng)基混合，充分?jǐn)嚢韬笱b于500 g取樣袋中，密封后放于生化培養(yǎng)箱中30℃恒溫發(fā)酵。

1.4 測(cè)定方法

細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定：飼用細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定采用GB13093—91方法；

酵母菌總數(shù)的測(cè)定采用麥芽汁平板進(jìn)行稀釋涂平板計(jì)數(shù)；

游離棉酚的測(cè)定采用苯胺法（GB13086—91）。

2 結(jié)果與討論

2.1 脫酚細(xì)菌菌株的初篩結(jié)果(見(jiàn)表1)

表1 細(xì)菌菌株初始平板篩選試驗(yàn)結(jié)果

從表1可知，菌株B-1和B-2在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)單一而棉酚含量較高的棉仁汁培養(yǎng)基平板上長(zhǎng)勢(shì)良好。說(shuō)明其生長(zhǎng)和耐酚能力較強(qiáng)，并有可能利用棉酚作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長(zhǎng)代謝，從而起到降解棉酚的作用。而乳酸菌類在此條件下不具有這一特點(diǎn)。

2.2 脫酚酵母菌菌株的初篩結(jié)果(見(jiàn)表2)

表2 酵母菌菌株初始篩選試驗(yàn)結(jié)果

從表2可知，所選4株酵母菌均能在初始篩選固體培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)良好。其中菌株Y-4長(zhǎng)勢(shì)最好，平均每克培養(yǎng)基中含菌量可達(dá)10億個(gè)。

2.3 單個(gè)細(xì)菌在滅菌條件下生長(zhǎng)情況及脫酚率的試驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)表3)

由以上結(jié)果，我們可以看出乳酸菌類在滅菌后的固體發(fā)酵培養(yǎng)基上生長(zhǎng)差，可能是因?yàn)槠鋵?duì)營(yíng)養(yǎng)要求較高，而棉仁汁培養(yǎng)基中不僅營(yíng)養(yǎng)物單一，還含有較高的游離棉酚。并且高溫滅菌過(guò)程可能會(huì)對(duì)棉粕中的一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)造成了破壞，不利于乳酸菌的生長(zhǎng)，從而也導(dǎo)致乳酸菌類對(duì)棉酚的脫除效果不好。而芽孢桿菌屬的兩株菌B-1和B-2在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)良好，說(shuō)明其對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求低，生長(zhǎng)能力較強(qiáng)。其中菌株B-2對(duì)棉粕中游離棉酚有較強(qiáng)的脫除效果，其脫酚率達(dá)到35%。

表3 細(xì)菌單菌固態(tài)發(fā)酵脫酚率的測(cè)定結(jié)果

2.4 單個(gè)酵母菌在滅菌條件下生長(zhǎng)情況及脫酚率的試驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)表4)

表4 酵母菌單菌固態(tài)發(fā)酵生長(zhǎng)情況及脫酚率的測(cè)定結(jié)果

從以上4株酵母菌在滅菌條件下脫酚率的試驗(yàn)結(jié)果可以看出，4株酵母菌中菌株Y-4的脫酚率最高，為41.4%，其次是菌株Y-3為22.4%，菌株Y-1的脫酚率為15.9%，而菌株Y-2只有5.0%。分析原因可能是因?yàn)?株酵母菌中Y-4和Y-3在固體發(fā)酵培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)更好，其活菌總數(shù)均可達(dá)到108cfu/g，從而增強(qiáng)了菌體細(xì)胞對(duì)棉酚的降解。

2.5 單個(gè)細(xì)菌在不滅菌條件下生長(zhǎng)情況及脫酚率的測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)表5)

表5 不滅菌條件下6株細(xì)菌生長(zhǎng)情況及固態(tài)發(fā)酵脫酚率的試驗(yàn)結(jié)果

6株細(xì)菌在不滅菌條件下進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，均對(duì)培養(yǎng)基中游離棉酚具有一定的脫除作用。其中乳酸菌屬的菌株在物料不滅菌條件下生長(zhǎng)情況和脫酚率都比滅菌條件下好?？赡苁且?yàn)槲锪衔唇?jīng)高溫滅菌，消除了高壓滅菌對(duì)物料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的影響，促進(jìn)了這些菌的生長(zhǎng)。另一方面物料中自然菌的繁殖對(duì)目標(biāo)菌的生長(zhǎng)和游離棉酚的降解也可能起到了一定的促進(jìn)作用。而菌株B-2在物料不滅菌條件下脫酚率也比其他菌株好，達(dá)到了38.2%。因此確定主要脫酚細(xì)菌菌株為：B-2。

2.6 單個(gè)酵母菌在不滅菌條件下生長(zhǎng)情況及脫酚率的測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)表6)

表6 不滅菌條件下4株酵母菌固態(tài)發(fā)酵脫酚率的試驗(yàn)結(jié)果

由以上結(jié)果可知菌株Y-4在物料是否滅菌上的脫酚率差異不顯著，說(shuō)明菌株Y-4受外界影響較小，脫酚能力比較穩(wěn)定，并且菌株Y-4及Y-3的脫酚率始終優(yōu)于其他兩株菌。菌株Y-2及Y-1在未滅菌物料上的脫酚率明顯高于滅菌物料上的脫酚率，這可能是因?yàn)槲礈缇锪现械淖匀痪纳L(zhǎng)對(duì)這兩株菌的脫酚效果具有一定的促進(jìn)作用。從活細(xì)胞數(shù)上可以看出菌株Y-4和Y-3長(zhǎng)勢(shì)略優(yōu)于其他兩株菌，與前期試驗(yàn)結(jié)果一致。在游離棉酚的測(cè)定結(jié)果中，菌株Y-4脫酚能力最強(qiáng)，脫酚率最高為47.5%，Y-3次之為44.6%。因此，確定最佳脫酚酵母菌為Y-4。

3 討論

3.1 脫酚菌株的篩選

為了能達(dá)到通過(guò)微生物發(fā)酵降解棉粕中游離棉酚的目的并實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大生產(chǎn)，本試驗(yàn)參考了前人研究的成果并結(jié)合了本公司現(xiàn)有的生產(chǎn)工藝及產(chǎn)品特點(diǎn)，將菌種篩選范圍縮小在芽孢桿菌、酵母菌和乳酸菌三個(gè)菌屬的十株菌中，具有一定的局限性。在棉粕原料、棉地土壤等其他環(huán)境中可能存在更為有效地降解棉粕中游離棉酚的菌種資源，有待于進(jìn)一步研究。

3.2 高壓滅菌的作用

為了消除雜菌的影響，有效的測(cè)定所選菌株對(duì)棉粕中游離棉酚的降解作用，試驗(yàn)先期采取了對(duì)固體發(fā)酵培養(yǎng)基高壓滅菌處理。試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，固體發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌處理后，其所含游離棉酚含量明顯降低。這和施安輝、賈曉鋒等得出的結(jié)果一致。因高溫高壓有助于使游離棉酚變成結(jié)合棉酚，對(duì)微生物脫酚能力的篩選不利，并且在工業(yè)化大生產(chǎn)中對(duì)大宗原料進(jìn)行高溫高壓滅菌處理難度很大、成本高，難以實(shí)現(xiàn)。于是又研究了對(duì)固體發(fā)酵培養(yǎng)基不滅菌處理，綜合了滅菌和不滅菌兩種方式下不同菌株的脫酚效果，從中篩選出了能高效降解棉粕中游離棉酚的有效菌種B-2和Y-4。

3.3 菌種的組合

試驗(yàn)研究了3個(gè)不同微生物屬中的10株不同菌在單菌發(fā)酵過(guò)程中對(duì)棉粕中游離棉酚的降解情況。為了彌補(bǔ)單個(gè)菌種的不足，目前大多數(shù)研究者都傾向于進(jìn)行復(fù)合菌發(fā)酵。如張文舉等利用熱帶假絲酵母ZD-3和黑曲霉ZD-8對(duì)棉籽餅底物進(jìn)行復(fù)合發(fā)酵，可極顯著降低棉籽餅底物中游離棉酚含量，脫毒率為91.64%。夏新成等利用復(fù)合發(fā)酵(兩株酵母和一株霉菌)可顯著降低棉籽粕底物中游離棉酚含量，最高降解率達(dá)86.24%。因此有必要對(duì)本試驗(yàn)所篩選出來(lái)的菌種進(jìn)行不同比例的復(fù)配，進(jìn)一步研究在不同菌種組合條件下，復(fù)合菌的脫酚效果，以提高脫酚率。

4 結(jié)論

從實(shí)驗(yàn)室保藏的可用于動(dòng)物飼料生產(chǎn)的10株菌中篩選出了2株能有效降解棉粕中游離棉酚的菌株Y-4和B-2。通過(guò)在滅菌條件下的固態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)，確定了各個(gè)菌株的脫酚率，其中菌株Y-4和B-2脫酚率最高分別為41.4%和35%。為了實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大生產(chǎn)，進(jìn)行了不滅菌條件下的固態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果表明各個(gè)菌株均對(duì)棉粕中的游離棉酚具有一定的降解作用，其中菌株Y-4和B-2的脫酚率較高，分別為47.5%和38.2%。

該研究結(jié)果對(duì)微生物發(fā)酵降解棉粕中游離棉酚提供了高效菌株，也為進(jìn)一步探索菌株Y-4、Y-3及B-2發(fā)酵脫酚條件奠定了基礎(chǔ)，對(duì)于微生物發(fā)酵降解棉粕中游離棉酚的工業(yè)化生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義。

18篇，刊略，需者可函索）