河南周口番茄黃化曲葉病病原分子鑒定

胡京昂 ，劉雪霞 ，蔡雨惠 ，曹剛強(qiáng) ，應(yīng)芳卿

番茄黃化曲葉病 （Tomato yellow leaf curl disease，TYLCD）是威脅番茄生產(chǎn)的一種嚴(yán)重病害，發(fā)病的植株葉片邊緣呈鮮黃色、卷曲，葉脈褪綠，葉肉變厚，葉片變小，嚴(yán)重時植株矮化萎縮，一旦發(fā)生，番茄產(chǎn)量會受到很大的損失，嚴(yán)重時造成絕產(chǎn)。近幾年該病在中國自南向北迅速傳播蔓延，廣東、江蘇、安徽、山東、河北、河南、浙江、上海、北京、臺灣等地均已有報道[1~9]。在國內(nèi)大部分省市該病是由雙生病毒科 （Geminiviridae）菜豆金色花葉病毒屬（Begamovirus） 番茄黃化曲葉病毒 （Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）侵染引起。

TYLCV寄主主要是番茄、曼陀羅、辣椒、菜豆和煙草等，傳毒介體為煙粉虱，同時可經(jīng)嫁接傳播，但不能經(jīng)機(jī)械摩擦和種子傳毒[10]。番茄黃化曲葉病毒病已經(jīng)成為為害世界許多地區(qū)番茄生產(chǎn)的毀滅性病害，已給熱帶和亞熱帶地區(qū)很多國家的番茄生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。

2007年在黃河以南的扶溝縣夏秋茬番茄和開封縣、中牟縣越冬溫室番茄地里均發(fā)現(xiàn)典型黃化曲葉癥狀，且煙粉虱發(fā)生嚴(yán)重；2008年在黃河以北的內(nèi)黃縣也發(fā)生類似的癥狀；自2009年以來，除新野縣以外，河南各番茄產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，主產(chǎn)區(qū)發(fā)生尤為嚴(yán)重。為了明確引起河南省番茄黃化癥狀的病毒種類及其起源變異，2011年秋季我們在病區(qū)采集病樣，并對其部分基因組進(jìn)行了克隆和分析，結(jié)果表明，引起河南省番茄黃化曲葉癥狀的病原為番茄黃化曲葉病毒，這是該病毒病在河南地區(qū)發(fā)生的首次分子檢測報道。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

病樣采集：2011年秋季在周口地區(qū)采集具有黃化曲葉病毒病典型癥狀，植株矮化、葉片卷曲、葉色褪綠、葉片增厚、具黃化癥狀的番茄葉片，-80℃保存?zhèn)溆茫幪枮镠N-ZK。

菌株與載體：大腸桿菌DH5a、pMD18-T載體均購自寶生物（大連）有限公司。

1.2 葉片總DNA提取

利用CTAB法提取番茄葉片總DNA，取0.1 g番茄葉片樣品，液氮中充分研磨，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管，加入600μL 65℃ 預(yù)熱的3%CTAB抽提緩沖液 （3%CTAB，200 mmol/L Tris-HCl，140 mmol/L NaCl，40 mmol/L EDTA，0.2%巰基乙醇)， 混勻后于65℃ 溫育 30 min，再用 600 μL 氯仿/異戊醇（24∶1）抽提兩次后，上清液中加入等體積的異丙醇，經(jīng)異丙醇沉淀后，取沉淀經(jīng)70%乙醇洗滌，干燥后溶于TE中，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴(kuò)增、克隆和序列分析

根據(jù)雙生病毒共同區(qū)及外殼蛋白基因保守序列設(shè)計(jì)簡并引物 PA/PB[11]。 PA：5′-TAATATTACCKGWKGVCCSC-3′，PB：5′-TGGACYTTRCAWGGBCCTTCACA-3′（K=G 或 T；W=A 或 T；V=A，C 或G；S=C 或 G；Y=C 或 T；R=A 或 G；B=C，T 或 G），擴(kuò)增雙生病毒基因間隔區(qū)和部分外殼蛋白基因約500 bp的特異片段，并進(jìn)行克隆和序列測定，上述引物由北京賽百盛生物技術(shù)有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系：10×PCR反應(yīng)緩沖液 2.5μL，dNTPs 1.0 μL （2.5 mmol/L），PA/PB 引物各 1.0 μL（100 ng/μL），Taq 酶 0.2 μL （5 U/μL）， 模板 DNA 1.0μL，加ddH2O至總體積25μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，按下列條件進(jìn)行 30個循環(huán)（94℃變性 45 s，50℃復(fù)性 45 s，72℃延伸 1 min），72℃延伸10 min。取5μL PCR產(chǎn)物，加入loading buffer和Gene Finder后，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，在可見光透視儀上顯示電泳結(jié)果。經(jīng)杭州博日科技有限公司的膠回收試劑盒純化約500 bp PCR產(chǎn)物，把純化后的PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體（TaKaRa），陽性克隆經(jīng)驗(yàn)證后送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司測序。

1.4 序列分析

獲得的DNA序列用DNAMAN Version 4.0進(jìn)行處理和分析，根據(jù)相似性明確病毒種類，進(jìn)化樹構(gòu)建采用Mega 4.0的臨近相鄰法 （Neighbor-joining）。序列比對和進(jìn)化分析中所用病毒（分離物）有：番茄黃化曲葉病毒廊坊分離物 （TYLCV-Langfang；JF833036），番茄黃化曲葉病毒浙江分離物 （TYLCV-ZJHZ12；FN256256），中國番茄黃化曲葉病毒四川分離物（TYLCV-SC65A-3；GU199588），中國番茄黃化曲葉病毒廣西分離物 （TYLCV-CHI；AF311734），廣東番茄黃化曲葉病毒廣東分離物（TYLCGDV-G3；AY602166），番茄黃化曲葉病毒安徽分離物（TYLCV-AH-HB1；FN650807），番茄黃化曲葉病毒江蘇分離物 （TYLCV-JSNJ1；FN256259），番茄黃化曲葉病毒北京分離物 （TYLCV-Beijing3；GU983859），番茄黃化曲葉病毒上海分離物（TYLCV-sh10；EU031444）。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR檢測結(jié)果

以提取的番茄葉片DNA為模板，用通用引物PA/PB進(jìn)行PCR檢測，從HN-ZK樣品中擴(kuò)增出約500 bp的特異性條帶（圖1），結(jié)果表明，河南周口種植的番茄被煙粉虱傳播的雙生病毒侵染。

2.2 序列分析

圖1 PCR檢測結(jié)果M：DL1000 DNA Marker；1：HN-ZK 樣品

圖2 雙生病毒基因組DNA-A部分片段核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

將PCR得到的500 bp左右的條帶回收并克隆測序，序列全長為539 bp，序列的GenBank登錄號為JQ754307。獲得的DNA序列用DNAMAN Version 4.0進(jìn)行處理和分析，該序列與番茄黃化曲葉病毒分離物AH-HB1的序列相似性高達(dá)98.7%，與其他番茄黃化曲葉病毒分離物序列相似性均在97%以上，而與中國番茄黃化曲葉病毒和廣東番茄黃化曲葉病毒分離物序列相似性均在75%以下，這表明樣品HN-ZK已被番茄黃化曲葉病毒感染而導(dǎo)致番茄黃化曲葉病的發(fā)生。將樣品雙生病毒基因組DNA-A部分片段與其他9個具有代表性的雙生病毒分離物核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)關(guān)系樹（圖2），結(jié)果顯示，廣東番茄黃化曲葉病毒、中國番茄黃化曲葉病毒和番茄黃化曲葉病毒分別在3個不同的分支，其中河南分離物與來源于安徽、上海、浙江、江蘇、河北廊坊和北京的番茄黃化曲葉病毒分離物單獨(dú)聚為一個小分支，河南分離物與安徽分離物親緣關(guān)系相對較近。

3 結(jié)論與討論

近幾年，番茄黃化曲葉病在河南省各地相繼暴發(fā)，特別是秋延后番茄，給我省的番茄生產(chǎn)造成了巨大的損害。本研究利用分子生物學(xué)技術(shù)，檢測了河南周口番茄黃化曲葉病的病原，通過PCR、克隆測序發(fā)現(xiàn)，侵染周口番茄的雙生病毒為番茄黃化曲葉病毒。鑒于該病在我國的傳播基本呈現(xiàn)自南向北、自東向西的蔓延趨勢，以及序列對比表明，河南分離物與安徽分離物序列相似性最高達(dá)到98.7%，從構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹也可以看出，河南分離物與安徽分離物的親緣關(guān)系最近，推測河南番茄黃化曲葉病毒可能來源于安徽。

雙生病毒種類繁多，在上海、浙江、江蘇、安徽和北京等省市多為番茄黃化曲葉病毒侵染引起，河南的番茄黃化曲葉病已經(jīng)初步鑒定為番茄黃化曲葉病毒侵染，但本研究僅克隆測序了一個地區(qū)的病害樣本，下一步將在河南各地采集病害樣本，進(jìn)行全面的檢測和鑒定，徹底明確河南省內(nèi)為害番茄的雙生病毒種類和分布。

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