食管癌耐藥皮下移植瘤裸鼠模型的建立

劉 亮，左 靜，左連富*，郭建文，李金丫

（河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院1.腫瘤研究所流式細胞室;2.腫瘤內科，河北石家莊 050011）

食管癌耐藥皮下移植瘤裸鼠模型的建立

劉 亮1，左 靜2，左連富1*，郭建文1，李金丫1

（河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院1.腫瘤研究所流式細胞室;2.腫瘤內科，河北石家莊 050011）

目的 建立食管癌耐藥裸鼠模型及探討食管癌耐藥機制。方法 4周齡的BALB/c nu/nu裸小鼠36只，隨機分為6組，左前肢肩胛下皮下分別接種食管癌細胞Eca109及食管癌耐藥細胞Eca109/ABCG2，建立裸鼠皮下移植瘤模型。成瘤后腹腔注射阿霉素（ADM）1、4 mg/kg。RT-PCR方法檢測移植瘤細胞中三磷酸腺苷結合轉運蛋白G2（ABCG2）mRNA表達，流式細胞術檢測移植瘤細胞中ABCG2蛋白、凋亡及細胞中ADM含量。結果 成功建立裸鼠食管癌耐藥細胞移植瘤模型，皮下接種細胞1周后成瘤，成瘤率100%。注射ADM，接種Eca109/ABCG2細胞的裸鼠皮下移植瘤體積、質量和ABCG2表達量顯著高于接種Eca109細胞移植瘤（P＜0.05），但細胞凋亡率及細胞內ADM含量顯著降低（P＜0.05）。結論 接種Eca109/ABCG2細胞的裸鼠皮下移植瘤模型是具有ABCG2耐藥表型的食管癌耐藥動物模型。

食管鱗狀細胞癌;流式細胞術;多藥耐藥;三磷酸腺苷結合轉運蛋白G超家族成員2

*通信作者（corresponding author）:zuolianfu4909@sina.com

食管癌是世界范圍內較常見的惡性腫瘤，發(fā)病率及病死率較高，嚴重威脅著人們的生命健康。目前食管癌的治療主要依靠手術，放療及化療。手術仍是目前首選的治療方法，但對于一些晚期腫瘤或由于其他原因不能手術的患者，往往會選擇化療，在化療過程中出現的多藥耐藥 （multidrug resistance，MDR）嚴重影響了治療的效果，甚至導致化療失敗。目前食管癌多藥耐藥機制仍未闡明，且缺乏食管癌耐藥動物模型。研究發(fā)現三磷酸腺苷結合盒 （ATP-binding cassette，ABC）轉運蛋白與腫瘤多藥耐藥有關［1］，ABCG2是近年來發(fā)現的與腫瘤多藥耐藥有關的ABC家族成員［2］，但與食管癌耐藥關系的研究較少。本研究利用動物模型研究ABCG2與食管癌耐藥的關系，建立食管癌耐藥裸鼠模型，初步探討食管癌多藥耐藥機制，為食管癌耐藥逆轉尋找新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系來源及實驗動物:人食管鱗狀細胞癌細胞系Eca109，本實驗室培養(yǎng)、傳代。人食管癌耐藥細胞系Eca109/ABCG2細胞本實驗室構建培養(yǎng)［3］。

BALB/c nu/nu裸小鼠36只，4周齡，雌雄各半，體質量17～20 g，購自中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所［動物許可證編號:SCXK（京）2005-0013］，飼養(yǎng)于河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院動物實驗中心清潔級動物室內（SPF級）。

1.1.2 主要實驗儀器及試劑:Epics-XLⅡ型流式細胞儀（Beckman-Coulter公司）;FITC標記的ABCG2（5D3）抗體（Biolegend公司）;阿霉素（浙江海正藥業(yè)股份有限公司）;胎牛血清（杭州四季青公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)

人食管癌耐藥細胞系Eca109/ABCG2用含10% FBS的 RPMI1640培養(yǎng)基（含300 mg/L G418），于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實驗前 1周改換含 10%FBS（不含 G418）的 RPMI1640培養(yǎng)基。

1.3 荷瘤裸鼠動物模型建立及實驗分組藥物干預治療

取200 μL濃度為3×107個/mL處于對數生長期的Eca109、Eca109/ABCG2細胞分別接種至裸鼠左前肢肩胛皮下。

將36只裸鼠按體質量隨機分為6組，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)。其中注射Eca109及Eca109/ABCG2細胞裸鼠皮下種植瘤組各3組。裸鼠皮下注射細胞1周后成瘤率100%，開始用藥。

藥物注射方式及時間:1和4 mg/kg ADM，腹腔注射，1次/3d，共注射7次，對照組給予0.9%氯化鈉注射液。

1.4 ADM對裸鼠移植瘤生長抑制作用

1.4.1 繪制腫瘤生長曲線:實驗過程中隔日測量1次裸鼠的體質量并用游標卡尺測量腫瘤的長、短徑，繪制腫瘤生長曲線，腫瘤近似體積按公式V=ab2/2計算（a，b分別為腫瘤的最長、最短徑）。

1.4.2 計算腫瘤抑制率:藥物停用1 d后采用拉頸法統一無痛苦處死裸鼠，剝離皮下腫瘤稱重。腫瘤體積或質量抑制率=（對照組腫瘤體積或質量-實驗組腫瘤體積或質量）/對照組腫瘤體積或質量×100%。

1.5 標本采集

取出瘤體后，部分組織液氮凍存，用于RT-PCR檢測;部分瘤組織立即用網搓法制備單細胞懸液用于FCM檢測。

1.6 RT-PCR方法檢測移植瘤細胞中ABCG2 mRNA表達量

使用Trizol試劑提取組織細胞的總RNA，利用Promega A3500試劑盒進行反轉錄，以適量反轉錄所得的cDNA為模板，在TaqDNA聚合酶催化下進行PCR擴增。所用引物及擴增片段長度:ABCG2:正向引物:5'-GGTCAGAGTGTGGTTTCTGTAGCA-3'，反向引物:5'-GTGAGAGATCGATGCCCTGCTTTA-3'，擴增片段280 bp，GAPDH:正向引物:5'-ACCACAGTCC ATGCCATCAC-3'，反向引物:5'-TCCACCACCCTGTT GCTGTA-3'，擴增片段452 bp。取8 μL PCR 產物，在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，EB染色，紫外凝膠成像儀上觀察并拍照。用Gel-proAnalyzer3.1軟件分析擴增產物的吸光度（A）值，計算ABCG2（A）值與GAPDH（A）值的比值，對ABCG2mRNA表達強度進行半定量分析。

1.7 FCM檢測裸鼠皮下種植瘤細胞ABCG2蛋白、凋亡及細胞中ADM含量

應用網措法將瘤組織制備成單細胞懸液，調整細胞濃度為1×107個/mL。取單細胞懸液0.1 mL（含1×106個細胞），加入FITC標記的ABCG2抗體0.01 mL，室溫避光放置30 min，上機檢測，以平均熒光強度表示蛋白含量。取0.1 mL細胞懸液向其中加入PI染液1 mL，4℃染色30 min，上機檢測凋亡，以凋亡率表示凋亡狀態(tài)。取1 mL細胞懸液直接上機檢測，ADM可被488nm激光激發(fā)后發(fā)出紅光被流式細胞儀接收檢測，以平均熒光強度表示細胞內ADM含量。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 裸鼠皮下移植瘤模型建立

接種Eca109、Eca109/ABCG2細胞后，7 d左右開始成瘤，瘤體逐漸增大，成瘤率達100%。種植瘤呈圓形或橢圓形（圖1），待瘤體長至0.5 cm時開始用藥。

2.2 皮下移植瘤生長曲線及腫瘤生長抑制率

從皮下移植瘤生長曲線上可以看出，隨著時間延長，接種Eca109/ABCG2細胞皮下移植瘤的體積增長的速度較接種 Eca109細胞快，提示接種Eca109/ABCG2細胞皮下移植瘤對ADM產生耐藥（圖2）。1、4 mg/kg ADM 作用后，接種 Eca109/ABCG2細胞皮下移植瘤的體積及質量顯著高于接種Eca109細胞（P＜0.05），移植瘤的體積及質量抑制率顯著降低（P＜0.05）（表1，2）。

圖1 人食管癌細胞裸鼠皮下移植瘤Fig 1 Human esophageal cancer xenograft in nude mice

圖2 裸鼠皮下移植瘤生長曲線圖Fig 2 Growth curve of xenograft in nude mice

2.3 RT－PCR方法檢測接種不同細胞皮下移植瘤中ABCG2 mRNA表達差異

接種Eca109/ABCG2細胞的皮下移植瘤中ABCG2mRNA表達量顯著高于接種Eca109細胞的表達（P＜0.05）（表3）。

表1 ADM藥物作用后接種Eca109及Eca109/ABCG2細胞裸鼠皮下移植瘤體積及質量Table 1 Effect of ADM on the volume and weight of Eca109，Eca109/ABCG2 cells xenograft tumors in nude mice（±s，n=6）

表1 ADM藥物作用后接種Eca109及Eca109/ABCG2細胞裸鼠皮下移植瘤體積及質量Table 1 Effect of ADM on the volume and weight of Eca109，Eca109/ABCG2 cells xenograft tumors in nude mice（±s，n=6）

＊P ＜0.05 compared with Eca109/ABCG2 cells xenograft tumor.

drug dose（mg/kg）lls xenograft tumor volume（cm3） weight（g） volume（cm3） weight（g）Eca109/ABCG2 cells xenograft tumor Eca109 ce control 0 2.49±0.10 2.18±0.08 2.53±0.17 2.25±0.19 ADM 1 2.11±0.03 1.77±0.08 1.35±0.04* 1.13±0.13*4 1.16±0.09 0.90±0.03 0.71±0.04* 0.57±0.07*

表2 ADM藥物作用后接種Eca109及Eca109/ABCG2細胞裸鼠皮下移植瘤體積及質量抑制率Table 2 The volume and weight inhibition effect of ADM on the growth of Eca109，Eca109/ABCG2 cells xenograft tumors in nude mice（±s，%，n=6）

表2 ADM藥物作用后接種Eca109及Eca109/ABCG2細胞裸鼠皮下移植瘤體積及質量抑制率Table 2 The volume and weight inhibition effect of ADM on the growth of Eca109，Eca109/ABCG2 cells xenograft tumors in nude mice（±s，%，n=6）

＊P ＜0.05 compared with Eca109/ABCG2 cells xenograft tumor.

drug dose（mg/kg）Eca109/ABCG2 cells xenograft tumor inhibiti on rate Eca109 cells xenograft tumor inhibiti on rate volume weight volume weight control 0————ADM 1 15.30±1.17 18.93±2.80 46.71±1.67* 49.63±3.33*4 53.42±3.55 58.51±0.80 71.84±1.68* 74.79±2.75*

表3 接種Eca109及Eca109/ABCG2細胞裸鼠皮下移植瘤細胞ABCG2 mRNA及蛋白表達量Table 3 ABCG2 mRNA and protein expression of Eca109，Eca109/ABCG2 cells xenograft tumors（±s，n=6）

表3 接種Eca109及Eca109/ABCG2細胞裸鼠皮下移植瘤細胞ABCG2 mRNA及蛋白表達量Table 3 ABCG2 mRNA and protein expression of Eca109，Eca109/ABCG2 cells xenograft tumors（±s，n=6）

＊P ＜0.05 compared with Eca109/ABCG2 cells xenograft tumor.

drug dose（mg/kg）lls xenograft tumor ABCG2 mRNA ABCG2 protein ABCG2 Eca109/ABCG2 cells xenograft tumor Eca109 ce mRNA ABCG2 ptotein control 0 0.92±0.07 449.24±5.41 0.67±0.06* 358.64±13.21*ADM 1 0.93±0.07 450.30±13.59 0.68±0.06* 360.30±13.90*4 0.93±0.05 452.64±14.72 0.68±0.06* 362.58±17.04*

圖3 流式細胞術檢測移植瘤細胞中ABCG2蛋白表達量Fig 3 ABCG2 protein expression of xenograft tumors assayed by FCM

2.4 FCM方法檢測裸鼠皮下移植瘤細胞中ABCG2蛋白、凋亡及細胞中ADM含量

2.4.1 移植瘤細胞中ABCG2蛋白表達的差異:接種Eca109/ABCG2細胞的皮下移植瘤中ABCG2蛋白表達量顯著高于接種Eca109細胞的表達（P＜0.05）（表3，圖3），檢測的結果同RT-PCR一致。2.4.2 移植瘤細胞凋亡情況:相同濃度的ADM作用組，接種Eca109/ABCG2細胞的皮下移植瘤細胞凋亡率顯著低于接種Eca109細胞皮下移植瘤細胞凋亡率（P＜0.05）（表4）。

表4 ADM作用后接種Eca109及Eca109/ABCG2細胞皮下移植瘤細胞凋亡率Table 4 Effect of ADM on cell apoptosis of Eca109，Eca109/ABCG2 cells xenograft tumors（±s，%，n=6）

表4 ADM作用后接種Eca109及Eca109/ABCG2細胞皮下移植瘤細胞凋亡率Table 4 Effect of ADM on cell apoptosis of Eca109，Eca109/ABCG2 cells xenograft tumors（±s，%，n=6）

＊P ＜0.05 compared with Eca109/ABCG2 cells xenograft tumor.

drug dose（mg/kg）apoptosis rate Eca109/ABCG2 cells xenograft tumor Eca109 cells xenograft tumor control 0 12.15±0.73 11.96±0.96 ADM 1 13.05±0.56 21.09±0.86*4 26.56±0.80 32.12±1.58*

2.4.3 移植瘤細胞中ADM含量:相同濃度的ADM作用組，接種Eca109/ABCG2細胞的皮下移植瘤細胞中ADM含量顯著低于接種Eca109細胞的ADM含量（P＜0.05）（表5）。

表5 ADM作用后接種Eca109及Eca109/ABCG2細胞皮下移植瘤細胞內ADM含量Table 5 Content of ADM in Eca109，Eca109/ABCG2 cells xenograft tumors treated with ADM（±s，n=6）

表5 ADM作用后接種Eca109及Eca109/ABCG2細胞皮下移植瘤細胞內ADM含量Table 5 Content of ADM in Eca109，Eca109/ABCG2 cells xenograft tumors treated with ADM（±s，n=6）

＊P ＜0.05 compared with Eca109/ABCG2 cells xenograft tumor.

drug dose（mg/kg）the mean fluorescence intensity of ADM Eca109/ABCG2 cells xenograft tumor Eca109 cells xenograft tumor control 0 334.94±10.56 333.31±12.31 ADM 1 344.97±11.17 457.05±9.64**

3 討論

腫瘤多藥耐藥是影響化療效果的重要因素。目前化療已是腫瘤常規(guī)治療方法之一，與手術和放療并稱腫瘤的3大治療方法。對于一些晚期腫瘤或其他原因失去手術機會的患者，往往會選擇化療。因此，化療在腫瘤的治療上起著重要的作用?；熯^程中出現的多藥耐藥嚴重影響化療療效，甚至會導致化療失敗。因此闡明腫瘤多藥耐藥機制，對于多藥耐藥逆轉具有重要意義。目前研究發(fā)現一類跨膜蛋白與腫瘤多藥耐藥關系密切，這類跨膜蛋白多為三磷酸腺苷結合轉運蛋白家族成員［4-6］，ABCG2是近來發(fā)現的與腫瘤多藥耐藥有關的因子［7-11］。ABCG2又稱乳腺癌耐藥蛋白，是從人乳腺癌耐藥細胞系MCF-7/AdrVp分離得到的［12］，由655個氨基酸組成的跨膜蛋白，可以將細胞中的化療藥物泵出細胞外降低細胞內化療藥物有效濃度從而產生耐藥。研究多圍繞乳腺癌和白血病等，少見在食管癌中的研究。

食管癌化療過程中產生多藥耐藥也是較常見的現象，尤其對于復發(fā)性腫瘤多藥耐藥就更為普遍。目前食管癌多藥耐藥產生機制仍未闡明，且缺乏研究耐藥機制的動物模型。本研究將食管癌耐藥細胞Eca109/ABCG2［3］接種于裸鼠皮下建立食管癌皮下移植瘤耐藥動物。實驗中從裸鼠皮下移植瘤生長曲線觀察到接種Eca109/ABCG2細胞的皮下移植瘤隨著天數的增加腫瘤體積較接種Eca109細胞增長迅速。提示接種Eca109/ABCG2細胞的裸鼠皮下移植瘤對ADM產生耐藥，食管癌耐藥細胞 Eca109/ABCG2接種于裸鼠皮下形成的移植瘤仍保持耐藥特性。

應用RT-PCR和FCM方法檢測到接種Eca109/ABCG2細胞的裸鼠皮下移植瘤細胞中ABCG2mRNA和蛋白表達量顯著增高，細胞內ADM含量和細胞凋亡率顯著減少，ABCG2的高表達成功解釋了細胞內ADM含量減少，導致對細胞的殺傷性降低（細胞凋亡率減少），最終產生耐藥的原因，ABCG2將進入細胞內的ADM泵出細胞外從而降低細胞內ADM有效濃度，產生耐藥，提示ABCG2與食管癌多藥耐藥有關。

綜合上述研究，此食管癌耐藥動物模型是具有ABCG2耐藥表型的多藥耐藥裸鼠模型，可作為研究食管癌多藥耐藥的動物模型。

食管癌多藥耐藥是多因素引起的，本課題小組在今后的實驗中會進一步研究其他耐藥途徑與食管癌多藥耐藥的關系，為闡明食管癌耐藥機制提供實驗基礎。

［1］ Shukla S，Ohnuma S，Ambudkar SV.Improving Cancer Chemotherapy with Modulators of ABC Drug Transporters［J］.Curr Drug Targets，2011，12:621-630.

［2］Polgar O，Robey RW，Bates SE.ABCG2:structure，function and role in drug response［J］.Expert Opin Drug Metab Toxicol，2008，4:1-15.

［3］劉亮，左靜，趙麗，等.ABCG2食管癌耐藥細胞系Eca109/ABCG2的建立［J］.解放軍醫(yī)學雜志，2010，35:32-35.

［4］Shi Z，Tiwari AK，Shukla S，et al.Sildenafil Reverses AB-CB1-and ABCG2-Mediated Chemotherapeutic Drug Resistance［J］.Cancer Res，2011，71:3029-3041.

［5］Zembruski NC，Büchel G，J?dicke L，et al.Potential of novel antiretrovirals to modulate expression and function of drug transportersin vitro［J］.J Antimicrob Chemother，2011，66:802-812.

［6］Pick A，Müller H，Mayer R，et al.Structure-activity relationships of flavonoids as inhibitors of breast cancer resistance protein（BCRP）［J］.Bioorg Med Chem，2011，19:2090-2102.

［7］Liu HG，Pan YF，You J，et al.Expression of ABCG2 and its significance in colorectal cancer［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2010，11:845-848.

［8］Dou J，Jiang C，Wang J，et al.Using ABCG2-molecule-expressing side population cells to identify cancer stem-like cells in a human ovarian cell line［J］.Cell Biol Int，2011，35:227-234.

［9］劉亮，趙麗，劉江惠，等.三磷酸腺苷結合轉運蛋白G超家族成員2基因在食管癌中的表達及意義［J］.中國醫(yī)科大學學報，2008，37:776-778.

［10］劉亮，左靜，趙麗，等.阿霉素誘導食管癌耐藥細胞中ABCG2的表達及其意義［J］.中國醫(yī)科大學學報，2010，39:101-104.

［11］劉亮，左靜，趙麗，等.ABCB1、ABCG2與食管癌患者多藥耐藥的關系［J］.中國老年學雜志，2011，31:15-17.

［12］Doyle L A，RossD D.Multidrug resistance mediated by the breast cancer resistance protein BCRP（ABCG2）［J］.Oncogene，2003，22:7340-7358.

Establishment of esophageal cancer drug resistant xenograft nude mice model

LIU Liang1，ZUO Jing2，ZUO Lian-Fu1*，GUO Jian-Wen1，LI Jin-Ya1

（1.Dept.of FCM Analysis，Tumor Institute;2.Dept.of Internal Oncology，the Forth Hospital of HeBei Medical University，Shijiazhuang 050011，China）

ObjectiveTo establish A nude mice model of esophageal cancer drug resistant xenograft and explore the mechanism of esophageal cancer drug resistance.MethodsThirty-six nude mice（BALB/c nu/nu，4 weeks old）were divided into six groups randomly.Nude mice were respectively inoculated with Eca109 or Eca109/ABCG2 cells subcutaneously in the left subscapularis to establish xenograft nude mice model.The experimental groups

ADM（1，4 mg/kg/3 d，respectively）for 7 times.ABCG2mRNA level of xenograft was detected by RTPCR.ABCG2 protein level，cell apoptosis and ADM content in cells of xenograft were detected by flow cytometry.ResultsThe model of esophageal cancer xenograft in nude mice was successfully established，the tumorigenic rate was 100%.In the same ADM concentration group，volume，weight and ABCG2 expression of transplanted tumor inoculated with Eca109/ABCG2 cells was significantly higher than that that inoculated with Eca109 cells（P＜0.05），but the cell apoptosis and ADM content was significantly lower（P＜0.05）.ConclusionsThe nude mice xenograft inoculated with Eca 1 0 9/ABCG 2 cells model is an ideal animal model of esophageal cancer drug resist-ance with ABCG2 resistance phenotype.

esophageal squamous cell carcinoma;Flow cytometry;multidrug resistance;ABCG2

R 735.1

A

1001-6325（2012）01-0077-06

2011-04-22

2011-07-22

河北省自然科學基金 （C2007001060）;河北省普通高等學校強勢特色學科腫瘤學建設經費（冀教高［2005］52號）;河北省醫(yī)學科學研究重點課題（20110131）