梅花鹿鹿茸膠原的理化特性研究

趙玉紅，金秀明

(東北林業(yè)大學林學院，黑龍江 哈爾濱 150040)

梅花鹿鹿茸膠原的理化特性研究

趙玉紅，金秀明

(東北林業(yè)大學林學院，黑龍江 哈爾濱 150040)

對胃蛋白酶法在酸性條件下制備的梅花鹿鹿茸膠原的理化性質進行研究。通過紫外掃描(UV)、傅里葉紅外光譜(FTIR)、氨基酸組成測定、聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和示差量熱掃描(DSC)等方法對其理化性質進行分析。紫外掃描圖譜可知，膠原純度較高，在230nm波長處有強吸收峰；紅外光譜表明其酰胺A、酰胺B、酰胺Ⅰ譜帶等主要吸收峰與Ⅰ型膠原標品一致，具有三螺旋結構；凝膠電泳表明鹿茸膠原含有α1、α2和β鏈，符合Ⅰ型膠原特征；氨基酸分析說明其具有典型膠原的氨基酸組成；示差量熱掃描測得其熱收縮溫度(ts)為84.05℃。梅花鹿鹿茸具有典型的I型膠原的理化特性。

梅花鹿鹿茸；膠原；大分子蛋白；結構特性；理化性質

膠原是一類富有多樣性和組織分布特異性的蛋白質的總稱[1]，是一種纖維狀、大分子結構蛋白，由3條肽鏈組成螺旋形纖維狀，主要分布于動物的皮膚、骨骼、肌腱、角膜等一些器官中。不同種族、不同組織中的膠原有著不同的化學組成和構成，目前，人們已發(fā)現(xiàn)26種不同類型的膠原，各類型間結構差異主要在于多肽鏈的初級結構不同。膠原具有重要的生理功能，起著支撐器官、保護機體，維持機體完整性的作用[2]，并與哺乳動物肌肉韌性有關[3]。國內外對膠原的利用主要分為兩類：一方面，膠原具有獨特的纖維性能，可用于相紙底片、紡織、造紙等[4]；另一方面，由于膠原具有良好的生物相容性、生物降解性，低的免疫原性、保濕活性以及大規(guī)模生產的可行性優(yōu)點，正在成為醫(yī)藥、化妝品和食品業(yè)的新寵[5]。由于膠原具有廣闊的市場前景，近年來對膠原性質的研究也日趨增多，其中主要是對海產品中膠原特性的研究[6-8]，而對鹿茸中膠原的研究較少。鹿茸是梅花鹿或馬鹿尚未骨化的幼角，含有膠原、多糖、磷脂等多種生物活性物質，具有廣泛的生理功能和藥理作用。對鹿茸膠原理化性質的研究局限于李銀清[9]采用醇法提取鹿茸膠原，并研究其部分理化性質，但未對其結構及熱穩(wěn)定性等性質進行分析。本實驗以梅花鹿鹿茸為原料，研究胃蛋白酶法提取的膠原的紫外光譜、紅外光譜、氨基酸組成、分子質量和熱收縮溫度等結構特性，以期為深入研究和利用鹿茸膠原提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

梅花鹿鹿茸 黑龍江大莊園集團。

胃蛋白酶、MD-44透析袋要、標準Ⅰ型膠原蛋白美國Sigma公司；冰乙酸、NaCl均為分析純。

PowerPac Basic電泳儀 美國Bio-Rad公司；TGL-20M低溫離心機 湖南凱達科學儀器有限公司；ALPHA1-2真空冷凍干燥機 德國Christ公司；L-8800氨基酸自動分析儀 日本日立公司；IR 560 E.S.P傅里葉變換紅外光譜儀 美國Nicolet公司；TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；Pyris 6熱流型示差掃描量熱儀 美國Perkin Elmer公司。

1.2 方法

1.2.1 梅花鹿鹿茸膠原的提取純化

將鮮鹿茸去皮，脫血后，切成2～3mm見方的小塊，乙醚浸泡處理2h進行初步脫脂。脫脂后冷凍干燥24h，粉碎，過40目篩。取一定量鹿茸粉末，用10倍體積的0.1mol/L NaOH溶液 4℃浸泡24h，蒸餾水洗至中性。固形物溶于0.5mol/L的醋酸和一定量胃蛋白酶中，4℃條件下提取72h，7600×g低溫離心20min，上清液于4℃保存?zhèn)溆?。所得沉淀重復提取兩次。合并上清液，即為鹿茸膠原粗提液。向膠原粗提液中加入固體氯化鈉至其濃度為2mol/L，鹽析過夜，10000r/min低溫離心30min，棄去上清液，將析出的膠原液移入透析袋中，透析4 8 h。冷凍干燥，得梅花鹿鹿茸膠原。

1.2.2 紫外光譜分析

取一定量的膠原用0.5mol/L的醋酸溶液溶解，配制成膠原溶液。另取0.5mol/L的醋酸溶液作為對照。兩種溶液分別加入1cm的石英比色皿后進行紫外分光光度測定，選擇波長范圍為200～400nm，進行掃描。

1.2.3 紅外光譜分析

紅外光譜可以檢測出膠原特有的基團吸收峰，已成為膠原分析中一種重要方法。取純化后樣品1～2mg，與一定量KBr置于研缽中，研磨成粉末狀后裝樣，手動壓片，用傅里葉變換紅外光譜儀在400～4000cm-1區(qū)間掃描，分辨率設置為4cm-1，掃描40次。

1.2.4 氨基酸分析

采用氨基酸自動分析儀，由哈爾濱市農業(yè)部谷物及制品質量監(jiān)督測試中心測定。檢驗方法：采用GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》。

1.2.5 SDS-PAGE分析

參考Laemmli[10]的方法，采用垂直電泳。10%分離膠，5%濃縮膠，考馬斯亮藍R250染色。上樣量30μL。

1.2.6 熱收縮溫度(ts)測定

采用示差掃描量熱儀(differential scanning calorimeter，DSC)測定。稱取6mg鹿茸膠原放入樣品池，放置DSC儀器的樣品支持器上，調整好儀器，開始實驗，并記錄結果。采用的測定溫度范圍為20～200℃，20℃保持1min，從20℃升溫到200℃，升溫速率為5℃/min，200℃保持1min，空白用空的樣品池作為參照。

2 結果與分析

2.1 鹿茸膠原紫外光譜分析

由于大多數(shù)蛋白質中存在酪氨酸和苯丙氨酸，使其在280nm波長附近有吸收峰。而所有蛋白質由于多肽的存在，在230nm波長附近有吸收峰。膠原中幾乎不含酪氨酸和苯丙氨酸[11]，因此，純膠原在280nm波長附近無吸收峰，在230nm波長附近有強吸收峰。據(jù)此也可檢測膠原的純度。

圖1 鹿茸膠原紫外吸收光譜Fig.1 UV spectrum of antler collagen

由圖1可知，酶法提取鹿茸膠原在230nm波長處有最大吸收峰，符合膠原紫外吸收特征[12]。在280nm波長處無明顯吸收峰，說明膠原純度較高。前期對鹿骨膠原特性進行研究，發(fā)現(xiàn)其最大吸收峰也在230nm波長處[13]，與本實驗結果相同；高金龍[14]研究山羊皮中膠原的最大吸收峰在233nm波長處，其差異可能是由于提取方法和原料氨基酸組成不同造成的。

2.2 鹿茸膠原紅外光譜分析

圖2 鹿茸膠原與標準Ⅰ型膠原紅外圖譜Fig.2 FT-IR spectra of antler collagen and type Ⅰ collagen

由圖2 可知，提取的鹿茸膠原與標準Ⅰ型膠原紅外圖譜基本一致。游離的N-H伸縮振動在3400～3440cm-1，而當N-H參與形成氫鍵，其振動頻率降低[15]。因此，鹿茸膠原3424cm-1是由酰胺A帶N-H伸縮振動形成的特征吸收峰，表明存在氫鍵，證明有三股螺旋結構的存在。酰胺B出現(xiàn)在2935cm-1，是由C-N伸縮振動引起的特征吸收峰。1658cm-1是由酰胺Ⅰ帶C＝O伸縮振動形成的特征吸收峰，它是多肽二級結構的一個靈敏指標。1558cm-1是酰胺Ⅱ帶的特征吸收峰，它是由N-H彎曲振動和C-H伸縮振動引起的。1157cm-1是C-N-C振動或C-O伸縮振動引起的特征吸收峰。紅外圖譜證明，提取的鹿茸膠原為Ⅰ型膠原，且保持良好的結構。

2.3 氨基酸組成分析

表1 鹿茸膠原的氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of antler collagen ‰

由表1可知，鹿茸膠原的氨基酸組成中甘氨酸含量最高，約占氨基酸總量的1/3，丙氨酸和脯氨酸含量也較高，酪氨酸、蛋氨酸和組氨酸含量較低，脯氨酸和羥脯氨酸含量為233，高于Su Xiurong等[16]報道的標準I型膠原標品(215殘基/1000總殘基)。羥脯氨酸與脯氨酸含量之比為0.75，符合Ⅰ型膠原特征[17]。

2.4 SDS-PAGE電泳分析

由圖3可知，膠原主要含有β鏈及兩條α鏈，即α1和α2，說明鹿茸膠原是Ⅰ型膠原。β鏈分子質量在200kD以上，α1鏈分子質量約為170kD，α2鏈分子質量約為160kD。這與之前研究的鹿骨膠原分子質量有些差異[13]，可能由于原料來源不同，其膠原分子質量大小也不相同。圖中幾乎不含其他雜帶，表明提取的鹿茸膠原純度較高。

圖3 鹿茸膠原電泳圖譜Fig.3 SDS-PAGE of antler collagen

2.5 熱收縮溫度測定

膠原熱收縮溫度是指蛋白質纖維收縮至1/3長度時的溫度。在收縮過程中，膠原結構發(fā)生改變，氫鍵斷裂，天然的三螺旋結構被破壞[18]。采用Pyris6.0軟件進行數(shù)據(jù)記錄和處理得到的DSC曲線，峰值點溫度為熱收縮溫度，曲線形成的峰包括的面積理論上為蛋白質變性所吸收能量。鹿茸膠原熱收縮溫度曲線如圖4所示。

圖4 鹿茸膠原熱收縮溫度曲線Fig.4 Thermal transition curve of antler collagen

由圖4可知，鹿茸膠原tS為84.05℃，高于一般脊椎動物膠原的tS61.67℃[19]。熱收縮溫度的差異主要與不同物種中膠原亞氨基酸(脯氨酸和羥脯氨酸)含量、身體溫度及環(huán)境溫度有關[20]。亞氨基酸的吡咯環(huán)對二級結構有固定化作用，以及羥脯氨酸的羥基所形成的氫鍵對膠原螺旋的穩(wěn)定化起著很大作用[21]。

3 結 論

梅花鹿鹿茸膠原在230nm波長處具有強特征峰；其紅外光譜吸收峰與Ⅰ型膠原一致；有典型的膠原的氨基酸組成；膠原分子質量較高且分子質量分布與I型膠原一致。鹿茸膠原的熱收縮溫度較高。本實驗提取的鹿茸膠原具有較完整的三螺旋結構，具有典型的I型膠原的理化特性。

[1]卓素珍. 鮟鱇魚皮膠原蛋白的性質及應用研究[D]. 杭州: 浙江工商大學, 2009.

[2]GELSE K, PO..SCHL E, AIGNER T. Collagen-structure, function, and biosynthesis[J]. Advanced Drug Delivery Reviews, 2003, 55(12): 1531-1546.

[3]KITTIPHATTANABAWON P, BENJAKUL S, VISESSANGUAN W, et al. Isolation and characterisation of collagen from the skin of brownbanded bamboo shark(Chiloscyllium puncatatum)[J]. Food Chemistry, 2010, 199(4): 1519-1526.

[4]肖玉良, 鄭連英, 韓俊芬, 等. 膠原蛋白研究進展[J]. 泰山醫(yī)學院學報, 2005, 26(5): 493-496.

[5]王孟津, 汪海波, 桂萌, 等. 草魚魚鱗膠原蛋白的提取及理化性質研究[J]. 食品科學, 2009, 30(18): 113-116.

[6]楊賢慶, 張帥, 郝淑賢, 等. 羅非魚皮膠原蛋白的提取條件優(yōu)化及性質[J]. 食品科學, 2009, 30(16): 106-110.

[7]NALINANON S, BENJAKUL S, KISHIMURA H, et al. Type I collagen from the skin of ornate threadfin bream(Nemipterus heχodon): characteristics and effect of pepsin hydrolysis[J]. Food Chemistry, 2011, 125(2): 500-507.

[8]崔鳳霞, 薛長湖, 李兆杰, 等. 仿刺參膠原蛋白的提取及理化性質[J].水產學報, 2006, 30(4): 549-553.

[9]李銀清. 梅花鹿茸膠原的分離提取及活性研究[D]. 長春: 長春中醫(yī)藥大學, 2007.

[10]LAEMMLI U K. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of the bacteriophage T4[J]. Nature, 1970, 227: 680-685.

[11]CUI Fengxia, XUE Changhu, LI Zhaojie, et al. Characterization and subunit composition of collagen from the body wall of sea cucumber Stichopus japonicus[J]. Food Chemistry, 2007, 100(3): 1120-1125.

[12]LIN Yungkai, LIU Dengcheng. Comparison of physical-chemical properties of typeⅠcollagen from different species[J]. Food Chemistry, 2006, 99(2): 244-251.

[13]趙玉紅, 高天. 鹿骨膠原蛋白特性的研究[J]. 食品科學, 2008, 29(7): 43-46.

[14]高金龍. 山羊皮中膠原蛋白的提取及理化特性研究[D]. 呼和浩特: 內蒙古農業(yè)大學, 2010.

[15]DOYLE B B, BENDIT E G, BLOUT E R, et al. Infrared spectroscopy of collagen and collagen-like polypeptides[J]. Biopolymers, 1975, 14: 937-957.

[16]SU Xiurong, SUN Bei, LI Yanyan, et al. Characterization of acid-soluble collagen from the coelomic wall of Sipunculida[J]. Food Hydrocolloids, 2009, 23: 2190-2194.

[17]王方, 沈珊安, 陳富強, 等. 正常和病變椎間盤纖維環(huán)中膠原的生化研究[J]. 首都醫(yī)藥, 2000, 4(7): 21-22.

[18]ZHANG Yan, LIU Wentao, LI Guoying, et al. Isolation and partial characterization of pepsin-soluble collagen from the skin of grass carp (Ctenopharyngodon idella)[J]. Food Chemistry, 2007, 103: 906-912.

[19]莊永亮. 海蜇膠原蛋白理化性質及其膠原肽的護膚活性研究[D]. 青島: 中國海洋大學, 2009.

[20]SINGH P, BENJAKUL S, MAQSOOD S, et al. Isolation and characterization of collagen extracted from the skin of striped catfish[J]. Food Chemistry, 2011, 124: 97-105.

[21]易繼兵, 李八方, 趙雪, 等. 獅子魚皮膠原蛋白的提取及理化性質研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2010, 31(4): 65-70.

Physico-chemical Properties of Sika Deer Antler Collagen

ZHAO Yu-hong，JIN Xiu-ming
(College of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China)

The physico-chemical properties of sika deer antler collagen extracted in acidic solution with pepsin were determined using ultraviolet (UV) spectroscopy, Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy, amino acid analyzer, SDS-PAGE and differential scanning calorimetry (DSC). A typical absorption peak at 230 nm was found in the UV spectrum. The FTIR spectrum showed that the amide A, B and Ⅰ spectral bands were consistent with those standard typeⅠ collagen with threespiral structure. SDS-PAGE results indicated that sika deer antler collagen was composed of one β-chain and two different αchains (α1 and α2), which were the characteristics of type Ⅰ collagen. Amino acid composition analysis revealed the characteristic amino acids of typeⅠ collagen. The tswas 84.05 ℃. On the basis of the analysis above, it could be concluded that sika deer antler collagen had typical physico-chemical properties of type Ⅰ collagen.

sika deer antler；collagen；macromolecular protein；structural characteristics；physico-chemical properties

Q816

A

1002-6630(2012)11-0075-04

2011-05-27

黑龍江省教育廳科學技術研究指導項目(11553036)

趙玉紅(1968—)，女，副教授，博士，研究方向為林特產品精深加工。E-mail：zhaoyuhong08@hotmail.com