熱處理辣椒醬貯藏過(guò)程中殘留微生物分析

丁 文，汪先丁，高 鵬，楊 虎，趙 敏，孫 群,*

(1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610064；2.四川省原子能研究院，四川 成都 610101)

熱處理辣椒醬貯藏過(guò)程中殘留微生物分析

丁 文1，汪先丁1，高 鵬2，楊 虎1，趙 敏1，孫 群1,*

(1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610064；2.四川省原子能研究院，四川 成都 610101)

四川郫縣辣椒醬多采用熱處理控制微生物生長(zhǎng)以延長(zhǎng)貨架期，但熱處理后殘留微生物仍會(huì)導(dǎo)致辣椒醬腐敗。辣椒醬經(jīng)80℃、30min熱處理后室溫貯藏120d期間檢測(cè)其中菌落總數(shù)、大腸菌群、霉菌和酵母數(shù)，分別采用16S rDNA和ITS序列鑒定分離的細(xì)菌和真菌菌株，并運(yùn)用PCR-DGGE法分析貯藏終點(diǎn)辣椒醬中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明：熱處理后辣椒醬中微生物減少了90%以上，殘留微生物主要為芽孢桿菌(Bacillus sp.)，在貯藏期內(nèi)微生物數(shù)量則呈先上升后下降的趨勢(shì)；PCR-DGGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)貯藏終點(diǎn)辣椒醬中主要?dú)埩艏?xì)菌為乳酸菌(Pediococcus sp.和Lactobacillus sp.)和蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)。因此，熱處理可使辣椒醬中部分微生物致死、亞致死或轉(zhuǎn)為“存活但非可培養(yǎng)” (viable but non-culturable，VBNC)狀態(tài)，但殘留的芽孢桿菌(Bacillus sp.)和乳酸菌可能導(dǎo)致辣椒醬的腐敗。有效控制芽孢桿菌將是延長(zhǎng)辣椒醬貨架期的關(guān)鍵因素。

熱處理；貨架期；菌落總數(shù)；PCR-DGGE；VBNC

四川擁有享譽(yù)全國(guó)的四大菜系之一——川菜，而辣味無(wú)疑是川菜中的重要風(fēng)味之一。四川郫縣地區(qū)不僅出產(chǎn)著名的郫縣豆瓣，也有優(yōu)質(zhì)辣椒醬生產(chǎn)。郫縣辣椒醬選用優(yōu)良品種的紅辣椒，經(jīng)切碎、攪拌、鹽封后發(fā)酵1～2月生產(chǎn)而成，產(chǎn)品具有獨(dú)特的風(fēng)味，不僅供四川本地食用，也有銷(xiāo)往全國(guó)各地，甚至出口日本等國(guó)。然而，自然發(fā)酵的郫縣辣椒醬中微生物數(shù)量及其活性均較高，且辣椒醬鹽分一般不會(huì)太高(10%～15%)，因而在后期貯藏前需要采用適當(dāng)手段(如80℃熱處理30min)進(jìn)行微生物控制以保證其貨架期。但實(shí)際生產(chǎn)中熱處理效果有時(shí)不盡人意，依然存在貨架期不長(zhǎng)的問(wèn)題，所以對(duì)熱處理后辣椒醬中殘留微生物進(jìn)行準(zhǔn)確分析顯得十分重要，從而才能有的放矢地采用適當(dāng)抑菌劑或改進(jìn)滅菌方式，從而延長(zhǎng)辣椒醬的貨架期。

對(duì)于食品中微生物的研究，傳統(tǒng)上采用培養(yǎng)法統(tǒng)計(jì)微生物數(shù)量并分離得到純培養(yǎng)菌株。研究發(fā)現(xiàn)，辣椒表面可分離得到Lactobacillus χylosus、Pediococcus acidilactici、Pediococcus pentosaceus、Rhodotorula mucilaginosa等[1]，而米曲霉、醬油曲霉、黑曲霉、魯氏酵母和鹽水四聯(lián)球菌等則是湖南永豐辣醬自然發(fā)酵過(guò)程中的主要優(yōu)勢(shì)菌[2]。但是，傳統(tǒng)培養(yǎng)法往往在培養(yǎng)條件上受到限制，影響了分離培養(yǎng)的結(jié)果。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)方法的發(fā)展，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變形梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術(shù)逐漸應(yīng)用于食品中微生物的檢測(cè)。高秀芝等[3-4]運(yùn)用PCR-DGGE技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)Lactococcus lactis、Bacillus licheniformis、Bacillus pumilus等為傳統(tǒng)豆醬發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌；張琦等[5]則對(duì)郫縣豆瓣自然發(fā)酵過(guò)程中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行了研究分析，從中發(fā)現(xiàn)了Staphylococcus χylosus、Lactobacillus plantarum、Weissella confusa等。楊虎等[6]曾運(yùn)用培養(yǎng)法和16S rDNA-ARDRA分析研究了冷藏雞肉胴體中的細(xì)菌多樣性，但同時(shí)運(yùn)用培養(yǎng)法和非培養(yǎng)法研究辣椒或辣椒醬尚未見(jiàn)報(bào)道。通過(guò)分子生物學(xué)方法和傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法的結(jié)合，應(yīng)能更加全面地反映辣椒醬中的微生物數(shù)量及群落結(jié)構(gòu)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)郫縣辣椒醬進(jìn)行熱處理，研究其貯藏過(guò)程中微生物的數(shù)量變化，分離鑒定其中的可培養(yǎng)微生物，并結(jié)合PCR-DGGE技術(shù)進(jìn)一步分析微生物群落結(jié)構(gòu)，以期揭示熱處理對(duì)辣椒醬中微生物數(shù)量和種類(lèi)的影響，以及貯藏中導(dǎo)致腐敗的主要?dú)埩粑⑸锏姆N類(lèi)，從而為延長(zhǎng)辣椒醬貨架期提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

辣椒醬由四川郫縣豆瓣廠提供。

0.85 %滅菌生理鹽水、1×TE Buffer (pH7.6)、1× TAE Buffer (pH8.5)；聚丙烯酰胺、尿素、甲酰胺(均為分析純) 上海捷倍思基因技術(shù)有限公司；TaKaRa TaqTMDR100AM 日本TaKaRa公司；2×Taq PCR MasterMix KT201 天根生化科技(北京)有限公司；Primer EU27F、1492R、ITS1、ITS4 美國(guó)Invitrogen公司。

DZKW-4電子恒溫水浴鍋 北京中興偉業(yè)公司；S1000TMThermal Cycler PCR反應(yīng)儀、Universal Hood II凝膠成像系統(tǒng)、DCODE Universal Mutation Detection SystemTM通用突變檢測(cè)系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 培養(yǎng)基

平板計(jì)數(shù)瓊脂(PCA)培養(yǎng)基[7]、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)培養(yǎng)基[8]、孟加拉紅培養(yǎng)基[9]、PDA和PDB培養(yǎng)基[10]。

1.3 方法

1.3.1 辣椒醬的處理與分裝

將盛有(300±0.1)g辣椒醬的500mL燒杯使用保鮮膜和雙層報(bào)紙封口，于80℃恒溫水浴30min并迅速冷卻以模擬實(shí)際工藝，期間監(jiān)測(cè)辣椒醬中心溫度變化。另設(shè)未處理組。兩組辣椒醬均分裝入無(wú)菌PE袋(約15g/袋)。1.3.2熱處理辣椒醬微生物計(jì)數(shù)

在第1、7、14、20、40、60、120天各取3袋熱處理辣椒醬，另在第1天取3袋辣椒醬作為未處理組。無(wú)菌條件下從每袋稱(chēng)取10g辣椒醬，加入90mL 0.85%滅菌生理鹽水，180r/min振搖30min，制成10倍稀釋液，并梯度稀釋成100倍和1000倍的樣品稀釋液。菌落總數(shù)、大腸菌群計(jì)數(shù)、霉菌和酵母計(jì)數(shù)分別參照文獻(xiàn)[7-9]。

1.3.3 熱處理辣椒醬微生物種類(lèi)分析

1.3.3.1 微生物分離與基因組DNA的提取

根據(jù)菌落形態(tài)及預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)菌落總數(shù)的結(jié)果，選擇從熱處理辣椒醬第1、20、60、120天的菌落總數(shù)測(cè)定平板上挑取單菌落，劃線(xiàn)純化后選擇代表性菌株富集培養(yǎng)，取1.5mL培養(yǎng)液采用改良的CTAB法[11]提取基因組DNA作為后續(xù)PCR反應(yīng)模板。

1.3.3.2 細(xì)菌16S rDNA序列擴(kuò)增

選用細(xì)菌16S rDNA通用引物Eu27F (5＇-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3＇)和1492R (5＇-CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA-3＇)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(50μL)：10×PCR Buffer 5μL，2.5mmol/L dNTP 4μL，25mmol/L MgCl24μL，Taq DNA聚合酶 0.25μL，引物各1μL，ddH2O 30.75μL，模板DNA 4μL。反應(yīng)程序：94℃ 5min；94℃ 60s，50℃ 60s，72℃ 90s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10min[6]。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)。

1.3.3.3 真菌ITS序列擴(kuò)增

選用引物ITS1 (5＇-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3＇)和ITS4 (5＇-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3＇)。PCR反應(yīng)體系(50μL)：10×PCR Buffer 5μL，2.5mmol/L dNTP 4μL，25mmol/L MgCl23μL，Taq DNA聚合酶0.25μL，引物各1μL，ddH2O 31.75μL，模板DNA 4μL。反應(yīng)程序：95℃ 5min；95℃ 60s，55℃ 60s，72℃ 90s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)。

1.3.3.4PCR-DGGE分析細(xì)菌群落

在第120天取適量辣椒醬制成10倍稀釋液，取1.5mL勻液500r/min離心2min，取上清液10000r/min離心5min，收集沉淀經(jīng)改良的CTAB法[11]提取宏基因組DNA。

采用Nested PCR法。先用EU27F和1492R擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA，反應(yīng)程序同1.3.3.2節(jié)。然后用帶GC clamp (CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G)的通用引物GC-338f (5＇-GC clamp-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG-3＇)和518r (5＇-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3＇)，經(jīng)降落PCR擴(kuò)增16S rDNA V3區(qū)，反應(yīng)程序：94℃ 5min；94℃ 30s，60～55℃ 30s (每個(gè)循環(huán)降低0.5℃)，72℃ 30s，10個(gè)循環(huán)；94℃ 30s，55℃30s，72℃ 30s，25個(gè)循環(huán)；72℃ 10min[5]。PCR反應(yīng)體系均為(50μL)：2×Taq PCR MasterMix 25μL，引物各1μL，ddH2O 19μL，模板DNA 4μL。16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)；16S rDNA V3區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。

細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)PCR產(chǎn)物DGGE電泳、染色及圖像分析參考文獻(xiàn)[5]。切膠回收代表性條帶，加入40μL TE Buffer 4℃浸泡過(guò)夜，取上清為模板，用不含GC clamp的引物338f和518r再次擴(kuò)增16S rDNA V3區(qū)，反應(yīng)程序同上，反應(yīng)體系(50μL)：10×PCR Buffer 5μL，2.5mmol/L dNTP 4μL，25mmol/L MgCl24μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，引物各1μL，ddH2O 29.5μL，模板DNA 5μL。

1.3.3.5 序列分析

PCR產(chǎn)物測(cè)序后提交NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/)進(jìn)行Blast相似序列檢索，并于GenBank獲得序列登錄號(hào)(Accession No.)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel 2003 SP3和SPSS Statistics 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。使用ANOVA分析微生物數(shù)量變化的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱處理辣椒醬微生物計(jì)數(shù)結(jié)果

辣椒醬中心溫度在熱處理過(guò)程中呈上升趨勢(shì)，處理結(jié)束時(shí)達(dá)到最高溫度57℃。熱處理前后及貯藏過(guò)程中辣椒醬的菌落總數(shù)變化見(jiàn)圖1。熱處理后辣椒醬菌落總數(shù)由(5.25±0.05)(lg(CFU/g))降為(4.06±0.03) (lg(CFU/g))，說(shuō)明80℃熱處理30min有效殺滅了辣椒醬中超過(guò)90%的微生物。菌落總數(shù)在處理后第7天達(dá)到貯藏期內(nèi)的最大值(4.44±0.04) (lg(CFU/g))，相比第1天增加了約0.4 (lg(CFU/g)) (P＜0.05)。這可能是因?yàn)闊崽幚砗箅m有降溫處理但不夠徹底，且樣品堆積，從而導(dǎo)致了辣椒醬中殘留微生物的生長(zhǎng)。但熱處理使辣椒醬中微生物鈍化或產(chǎn)生了其他不可修復(fù)的損傷，從而抑制了微生物大量增殖，因此菌落總數(shù)在第7～40天期間維持在一定水平，并從第60天開(kāi)始下降，至第120天僅為(2.94±0.10) (lg(CFU/g))，相比第1天下降了1.12 (lg(CFU/g)) (P＜0.05)。菌落總數(shù)在貯藏后期的下降，可能是由于微生物逐漸死亡或是轉(zhuǎn)為“存活但非可培養(yǎng)”(viable but non-culturable，VBNC)[12]狀態(tài)。

另一方面，熱處理后辣椒醬中真菌數(shù)由72CFU/g降為不可檢出，說(shuō)明熱處理對(duì)辣椒醬中真菌也有殺滅作用，而未滅菌處理的辣椒醬中真菌數(shù)量很少，推測(cè)真菌可能不是發(fā)酵中的功能菌群，也不是熱處理辣椒醬貯藏過(guò)程中的腐敗菌。

大腸菌群在熱處理前后均未檢出，產(chǎn)品符合農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1070—2006《辣椒醬》。

圖1 熱處理辣椒醬貯藏過(guò)程中的菌落總數(shù)變化Fig.1 Total bacterial count in chili sauce before and after heat treatment

2.2 熱處理辣椒醬微生物的分離鑒定

表1 辣椒醬分離細(xì)菌16S rDNA序列分析Table 1 16S rDNA sequence analysis of bacteria isolated from chili sauce

從熱處理辣椒醬中分離純化得到6株可培養(yǎng)細(xì)菌，16S rDNA鑒定結(jié)果見(jiàn)表1?？梢钥闯?，從熱處理辣椒醬中分離的可培養(yǎng)細(xì)菌均為芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)，推測(cè)可能是由于Bacillus sp.細(xì)菌可形成芽孢從而逃避了熱處理的損害，從而大量存活。Bacillus sp.細(xì)菌可能是環(huán)境菌種，同時(shí)也具有一定的發(fā)酵和抑菌作用。有研究指出，細(xì)菌型豆豉發(fā)酵曲種主要是Bacillus subtilis，并且Bacillus subtilis和Bacillus amyloliquefaciens可產(chǎn)生具有顯著溶栓作用的豆豉纖溶酶[13]。高雅等[14]曾從自然發(fā)酵的郫縣豆瓣中分離得到一株Bacillus subtilis (L4)，該菌能有效抑制產(chǎn)毒黃曲霉的生長(zhǎng)及毒素的合成。熱處理辣椒醬中未檢出真菌，但自處理前辣椒醬中分離得到1株酵母菌F1。經(jīng)ITS序列分析比對(duì)，F(xiàn)1與菌株Rhodotorula mucilaginosa PYCC 4349 (AF444584)相似性達(dá)100%，序列提交GenBank并獲得登錄號(hào)JF338814。推測(cè)辣椒醬中的Rhodotorula mucilaginosa可能來(lái)自于原料辣椒[2]。相比其他微生物，Bacillus sp.細(xì)菌在熱處理壓力下具有更佳的存活能力，其數(shù)量在貯藏期內(nèi)占據(jù)著優(yōu)勢(shì)地位，具有潛在的致腐可能。但是，本研究采用的PCA培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件(37℃、48h、非厭氧)只適合部分細(xì)菌生長(zhǎng)，對(duì)于營(yíng)養(yǎng)要求復(fù)雜、生長(zhǎng)緩慢等生長(zhǎng)條件要求嚴(yán)苛的細(xì)菌可能無(wú)法成功培養(yǎng)。此外，經(jīng)熱處理作用，部分微生物細(xì)胞可能處于VBNC狀態(tài)，具有潛在的生長(zhǎng)能力及危害性[15]，但也未能進(jìn)一步驗(yàn)證和檢出。這些因素都影響了微生物分離鑒定的結(jié)果。

2.3 辣椒醬貯藏終點(diǎn)細(xì)菌群落PCR-DGGE分析

第120天時(shí)辣椒醬細(xì)菌群落PCR-DGGE指紋圖譜見(jiàn)圖2，DGGE條帶經(jīng)測(cè)序比對(duì)，序列鑒定結(jié)果表2。

表2 第120天辣椒醬細(xì)菌群落DGGE條帶比對(duì)分析Table 2 Identification of DGGE bands of bacteria isolated from chili sauce at day 120 of storage

由表2可知，辣椒醬貯藏終點(diǎn)第120天時(shí)的細(xì)菌群落主要為乳酸菌(Pediococcus sp.和Lactobacillus sp.)。乳酸菌可能對(duì)于辣椒醬的獨(dú)特風(fēng)味形成具有一定的影響，并可通過(guò)形成低pH值的環(huán)境抑制部分有害菌的生長(zhǎng)。據(jù)報(bào)道，Lactobacillus brevis是自然發(fā)酵東北酸菜中的優(yōu)勢(shì)菌[16]；Lactobacillus acidipiscis則曾在泰國(guó)豆醬中被發(fā)現(xiàn)[17]，而細(xì)菌群落中的Bacillus cereus則具有潛在的致腐性及致病性[18]。

與從辣椒醬中分離培養(yǎng)的細(xì)菌鑒定結(jié)果相比，DGGE圖譜中各條帶所代表的細(xì)菌種類(lèi)更多。這一方面可能是由于在熱處理辣椒醬中Bacillus sp.細(xì)菌數(shù)量上處于優(yōu)勢(shì)地位，在分離培養(yǎng)過(guò)程中抑制了Pediococcus sp.和Lactobacillus sp.細(xì)菌生長(zhǎng)，致使未獲得乳酸菌純培養(yǎng)菌株；另一方面也可能是由于Pediococcus sp.和Lactobacillus sp.細(xì)菌在熱處理辣椒醬中處于死亡或是VBNC狀態(tài)而無(wú)法通過(guò)培養(yǎng)法檢測(cè)，僅能通過(guò)PCR-DGGE證明其存在于辣椒醬中。有研究指出，由于基于DNA的PCR-DGGE可能因死細(xì)胞的存在而產(chǎn)生誤差，而rRNA的合成與細(xì)胞的生長(zhǎng)緊密相關(guān)，所以基于RNA的分析方法無(wú)疑更能提供關(guān)于微生物群落存活與代謝活性的有用信息。Han Yanqing等[19]對(duì)比了基于rDNA和rRNA的PCR-DGGE結(jié)果，顯示RNA-DGGE圖譜具有更高的微生物多樣性。

但另一方面，本研究的DGGE圖譜中僅出現(xiàn)1個(gè)條帶，經(jīng)鑒定為Bacillus sp.細(xì)菌(Bacillus cereus，相似度99%)，多樣性小于培養(yǎng)法，這可能是由于使用通用引物338f和518r擴(kuò)增16S rDNA V3區(qū)對(duì)于辨識(shí)Bacillus sp.細(xì)菌的檢測(cè)靈敏度不高，使得檢測(cè)存在一定的缺陷。Kim等[20]曾在研究中通過(guò)在16S rDNA擴(kuò)增之后增加一輪選擇性PCR (引物pB和1492R)，然后選用引物Ec1055和GC-Ec1392擴(kuò)增16S rDNA V9區(qū)，用于DGGE特異性檢測(cè)Bacillus sp.細(xì)菌，取得了很好的效果。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)使用培養(yǎng)法和非培養(yǎng)法(PCR-DGGE)研究了熱處理辣椒醬中的殘留微生物，結(jié)果顯示，熱處理對(duì)辣椒醬中微生物的控制取得了一定成效，殺滅了辣椒醬中90%以上的微生物；但是，熱處理辣椒醬中的某些殘留微生物(如Bacillus cereus)仍然具有潛在的致腐性和致病性，控制殘留的芽孢桿菌才能更有效地延長(zhǎng)辣椒醬的貨架期。

使用傳統(tǒng)的培養(yǎng)法檢測(cè)辣椒醬中的微生物，存在著培養(yǎng)基等條件上的限制，可能導(dǎo)致優(yōu)勢(shì)菌(如芽孢桿菌)在檢測(cè)中大量生長(zhǎng)；此外，某些微生物可能在熱處理后轉(zhuǎn)變?yōu)閂BNC狀態(tài)而無(wú)法通過(guò)培養(yǎng)法檢出，這也使得培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果往往不夠全面。而非培養(yǎng)法(PCR-DGGE)除了檢測(cè)出芽孢桿菌之外，還檢出了辣椒醬發(fā)酵過(guò)程中殘留的乳酸菌。因此，相比傳統(tǒng)上單獨(dú)使用培養(yǎng)法，非培養(yǎng)法(PCR-DGGE)與培養(yǎng)法的聯(lián)合應(yīng)用，能夠更加全面地反映并準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)辣椒醬中的微生物種類(lèi)，可為選用適

當(dāng)?shù)囊志鷦┗蚋倪M(jìn)滅菌方式提供科學(xué)依據(jù)。

[1]劉麗娜. 辣椒表面微生物區(qū)系的研究[D]. 重慶: 西南大學(xué), 2007.

[2]蘇東林, 張忠剛, 陳亮, 等. 永豐辣醬自然發(fā)酵過(guò)程中主要優(yōu)勢(shì)菌及化學(xué)成分的動(dòng)態(tài)變化分析[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(17): 212-216.

[3]高秀芝, 王小芬, 李獻(xiàn)梅, 等. 傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬發(fā)酵過(guò)程中養(yǎng)分動(dòng)態(tài)及細(xì)菌多樣性[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2008, 35(5): 748-753.

[4]高秀芝, 王小芬, 李獻(xiàn)梅, 等. 傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬與商品豆醬養(yǎng)分及微生物多樣性比較[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(3): 222-226.

[5]張琦, 汪先丁, 楊虎, 等. 郫縣豆瓣自然發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化[J]. 食品與發(fā)酵科技, 2010, 46(6): 16-18; 35.

[6]楊虎, 向文良, 張弛, 等. 培養(yǎng)和非培養(yǎng)法分析冷藏雞肉胴體中的細(xì)菌多樣性[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2010, 37(10): 1451-1456.

[7]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部. GB/T 4789.2—2010 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定[S]. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2010.

[8]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部. GB/T 4789.3—2010 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)[S]. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2010.

[9]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部. GB/T 4789.15—2010 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)[S]. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2010.

[10]東秀珠, 蔡妙英. 常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2001: 370.

[11]程志學(xué), 陳清華, 于遠(yuǎn), 等. 適合AFLP分析用的節(jié)瓜基因組DNA提取方法的研究[J]. 分子植物育種, 2009, 7(2): 420-424.

[12]LIAO Hongmei, ZHANG Liyun, HU Xiaosong, et al. Effect of high pressure CO2 and mild heat processing on natural microorganisms in apple juice[J]. International Journal of Food Microbiology, 2010, 137 (1): 81-87.

[13]汪孟娟, 陳廷濤, 姜淑英, 等. 豆豉發(fā)酵過(guò)程中的微生物和功能性組分研究動(dòng)態(tài)[J]. 中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志, 2010, 22(1): 81-84.

[14]高雅, 丁文, 張琦, 等. 傳統(tǒng)發(fā)酵豆瓣中產(chǎn)毒黃曲霉高效拮抗菌的篩選[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2010, 37(3): 369-374.

[15]ROWAN N J. Viable but nonculturable forms of food and waterborne bacteria: Quo Vadis？[J]. Trends in Food Science & Technology, 2004, 15(9): 462-467.

[16]張魯冀, 孟祥晨. 自然發(fā)酵東北酸菜中乳桿菌的分離與鑒定[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 41(11): 125-131.

[17]TANASUPAWAT S, THONGSANIT J, OKADA S, et al. Lactic acid bacteria isolated from soy sauce mash in Thailand[J]. Journal of General and Applied Microbiology, 2002, 48(4): 201-209.

[18]李志明, 郭潔, 崔希勇, 等. 黃豆醬類(lèi)食品的微生物狀況分析[J]. 中國(guó)調(diào)味品, 2008, 33(12): 75-76; 87.

[19]HAN Yanqing, XU Xinglian, JIANG Yun, et al. Inactivation of food spoilage bacteria by high pressure processing: evaluation with conventional media and PCR-DGGE analysis[J]. Food Research International, 2010, 43(6): 1719-1724.

[20]KIM T W, LEE J H, KIM S E, et al. Analysis of microbial communities in doenjang, a Korean fermented soybean paste, using nested PCR-denaturing gradient gel electrophoresis[J]. International Journal of Food Microbiology, 2009, 131(2/3): 265-271.

Analysis of Microbial Survival in Heat-Treated Pixian Chili Sauce during Storage

DING Wen1，WANG Xian-ding1，GAO Peng2，YANG Hu1，ZHAO Min1，SUN Qun1,*
(1. Key Laboratory of Bio-resource and Bio-environment, Ministry of Education, College of Life Science, Sichuan University, Chengdu 610064, China；2. Sichuan Institute of Atomic Energy, Chengdu 610101, China)

Heat treatment is often used to inhibit microbial growth in Pixian chili sauce for extending its shelf-life, but some microorganisms are still likely to survive, causing Pixian Chili Sauce to spoil during storage. In this study, Pixian chili sauce treated at 80℃ for 30 min was enumerated for total aerobic bacteria, coliforms, moulds and yeasts during storage at room temperature for 120 days. Bacterial and fungal strains isolated from chili sauce were identified by 16S rDNA and ITS sequence analysis respectively, and PCR-DGGE technique was used to analyze the bacterial community at the end of the storage period. The total number of bacteria in chili sauce decreased more than 90% after heat treatment at 80 ℃ for 30 min, and the majority of surviving microbes were Bacillus sp. During the storage period of 120 days, the total number of bacteria in heat treated chili sauce increased at first and then decreased. The dominant surviving bacteria in chili sauce at the end of the storage period, as detected by PCRDGGE, were Pediococcus sp., Lactobacillus sp. and Bacillus cereus. These results demonstrate that partial microorganisms in chili sauce are killed or presented in VBNC (viable but non-culturable) state after heat treatment, and surviving Bacillus sp. and lactic acid bacteria may be the reason for the spoilage of heat-treated chili sauce. Consequently, effectively controlling the survival Bacillus sp. and lactic acid bacteria is the key to extend the shelf-life of chili sauce.

heat treatment；shelf-life；aerobic bacteria count；PCR-DGGE；viable but non-culturable (VBNC)

Q939.99

A

1002-6630(2012)03-0146-05

2011-04-18

國(guó)家科技人員服務(wù)企業(yè)行動(dòng)項(xiàng)目(2009GJF00039)；四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2010NZ0051)；國(guó)際原子能機(jī)構(gòu)(IAEA)支持項(xiàng)目(16356/R0)

丁文(1986—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸锖褪称钒踩?。E-mail：davidting200518@yahoo.com.cn

*通信作者：孫群(1967—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸飳W(xué)和微生物技術(shù)。E-mail：qunsun@scu.edu.cn