蔣 偉,黎滿香,田世成,顏運(yùn)秋
(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙 410128)
在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中,細(xì)菌往往通過(guò)各種各樣的策略來(lái)使自己適應(yīng)各種環(huán)境,從而使細(xì)菌能在各種復(fù)雜的環(huán)境中生存。而在基因水平,細(xì)菌能獲得新的外源基因促使它抵抗環(huán)境選擇壓力,這是細(xì)菌進(jìn)化過(guò)程中的一個(gè)重要因素。很多細(xì)菌和古細(xì)菌都是從其他細(xì)菌中利用核酸交換來(lái)獲得外源基因,這種交換被稱為基因水平轉(zhuǎn)移(horizontal gene transfer;HGT),例如糞腸球菌中約三分之一的基因組由可移動(dòng)性片段組成。HGT即是從環(huán)境中攝取可移動(dòng)性片段的DNA(例如質(zhì)粒,噬菌體等),然后整合到自己的基因組中從而獲得相應(yīng)的表型的過(guò)程。然而在這些水平轉(zhuǎn)移中,只有極少一部分能給細(xì)菌提供選擇優(yōu)勢(shì)。為避免冗于的水平轉(zhuǎn)移(即不能給宿主細(xì)菌提供選擇優(yōu)勢(shì)的水平轉(zhuǎn)移),細(xì)菌在進(jìn)化過(guò)程中形成了上百種的自我保護(hù)機(jī)制,例如目前了解最為透切的消除入侵生物的限制性修飾酶系統(tǒng)和表面排斥現(xiàn)象等[1]。
近期研究發(fā)現(xiàn),CRISPR位點(diǎn) (CRISPR loci)廣泛存于細(xì)菌及古細(xì)菌基因組中。其主要結(jié)構(gòu)以高度保守的重復(fù)序列、完全不同的間區(qū)相互交替排列而成,在這種重復(fù)序列遠(yuǎn)端還存在與這種重復(fù)序相關(guān)的蛋白,二者相互輔助以完成其特定的生物學(xué)功能。
Ishino Y等[2]在對(duì)大腸埃希菌中的堿性磷酸酶的同工酶Ipa對(duì)應(yīng)的核酸序列進(jìn)行分析時(shí),發(fā)現(xiàn)在該產(chǎn)物編碼區(qū)的下游存在一個(gè)由29個(gè)堿基組成的、重復(fù)出現(xiàn)的高度保守的核酸序列,兩個(gè)重復(fù)序列之間由長(zhǎng)度大致相等的獨(dú)特的非重復(fù)核酸序列間隔開(kāi)。隨后,Mojica F J等[3]在對(duì)地中海極嗜鹽菌(Haloferaxmediterranei)和沃爾卡尼極嗜鹽菌(Haloferax volcanii)的研究中發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)構(gòu)。在其他一些細(xì)菌的研究中,這種類似的基因結(jié)構(gòu)被廣泛報(bào)道。隨著類似的結(jié)構(gòu)被廣泛的發(fā)現(xiàn),直到1991年Hermans P W等才把這種結(jié)構(gòu)正式命名SRSR(short regularly spaced repeats),2002年被Jansen R改名為CRISPR并一直沿用至今[3-7]。隨著細(xì)菌的全基因組測(cè)定的完成,已經(jīng)在90%的古細(xì)菌及40%的細(xì)菌基因組中發(fā)現(xiàn)CRISPR位點(diǎn),更令人驚奇的是在大部分已發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)的細(xì)菌中含有至少1個(gè)CRISPR位點(diǎn),有的甚至含有2個(gè)或3個(gè)該位點(diǎn)[8]。
CRISPR位點(diǎn)由一個(gè)前導(dǎo)區(qū)(leader)、多個(gè)重復(fù)序列(repeat)和多個(gè)間區(qū)(spacer)組成,這些重復(fù)序列與間區(qū)相互交替出現(xiàn)并串連成一個(gè)完整的CRISPR位點(diǎn)(如圖1A)。前導(dǎo)區(qū)一般是處于CRISPR位點(diǎn)上游,由300bp~500bp堿基組成的一個(gè)AT富集的區(qū)域。這個(gè)區(qū)域一般來(lái)說(shuō)在種內(nèi)是比較保守的,但在種間卻有顯著的差異[7]。重復(fù)序列一般由23bp~50 bp的堿基組成,其平均長(zhǎng)度在31bp左右。這段序列在已給定的CRISPR位點(diǎn)的多個(gè)重復(fù)中相對(duì)保守,一般只存在1個(gè)~3個(gè)堿基差異,這種差異被稱為退化重復(fù)(degeneration repeats,DRs),但在微生種間甚至于同一個(gè)基因組中的兩個(gè)或多個(gè)不同的CRISPR位點(diǎn)間卻存在很大的差異。通過(guò)對(duì)CRISPR DataBase[8]中貯存的所有重復(fù)序列進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些重復(fù)序列間沒(méi)有明顯的聯(lián)系,但卻具有二重對(duì)稱性,這就意味著它能形成像發(fā)夾一樣的二極結(jié)構(gòu)。到目前為止,還沒(méi)有關(guān)于這些重復(fù)序列具體功能的描述。間區(qū)由17bp~84bp堿基組成,平均長(zhǎng)度在36bp左右。在同一個(gè)CRISPR位點(diǎn)中,基本上沒(méi)有相同或比較相似的間區(qū)。通過(guò)長(zhǎng)期的研究發(fā)現(xiàn),部分間區(qū)序列與已知的或質(zhì)粒、或噬菌體的序列相匹配[3]。在CRISPR DataBase中的間區(qū)序列,只有約2%的序列在Gen-Bank中能找到相應(yīng)的匹配,這可能是因?yàn)槟壳爸挥袠O少的噬菌體和質(zhì)粒被測(cè)序分析,隨著測(cè)序分析技術(shù)的逐漸成熟,這個(gè)比例在不斷的增加[9]。
圖1 CRISPR位點(diǎn)結(jié)構(gòu)圖(A代表CRISPR位點(diǎn);B代表整個(gè)CRISPR系統(tǒng))Fig.1 The structure of CRISPR-loci(A represents CRISPR loci;B represents the whole element of CRISPR system)
在生物機(jī)體內(nèi),最終起到調(diào)節(jié)生命作用的物質(zhì)是肽或者蛋白質(zhì),而如圖1A所示的整個(gè)區(qū)域都是非編碼區(qū),對(duì)于實(shí)現(xiàn)CRISPR位點(diǎn)的功能顯然不現(xiàn)實(shí)。因此,在微生長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中,為了使CRISPR宿主能適應(yīng)各種環(huán)境,必定有相關(guān)蛋白質(zhì)起著調(diào)節(jié)作用。Jansen R等[7]對(duì)CRISPR側(cè)翼序列進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)4段基因,并依次命名為cas1、cas2、cas3、cas4,這4段基因通常都與CRISPR位點(diǎn)同時(shí)出現(xiàn)于幾乎所有CRISPR位點(diǎn)陽(yáng)性細(xì)菌的基因組中,且這4段基因在不同的細(xì)菌基因組間具有顯著的同源性,說(shuō)明這4段基因可能與CRISPR位點(diǎn)存在某種關(guān)系。這些Cas蛋白或鄰接于CRISPR位點(diǎn)下游(圖1B),或分散于其他地方,目前發(fā)現(xiàn)距CRISPR位點(diǎn)最遠(yuǎn)的達(dá)到了9 kb。通過(guò)進(jìn)一步分析這些蛋白質(zhì)序列,發(fā)現(xiàn)存在高度保守的氨基酸殘基或/和功能結(jié)構(gòu)域(amino acid resi-dues or/and functional domains)。這4個(gè)蛋白通常以cas4-cas3-cas1-cas2的順序存在于染色體或質(zhì)粒上,其中Cas3類似于一種解旋酶,而Cas4類似于RecB家簇的一種半胱氨酸富集的核酸內(nèi)切酶上。這些酶的功能以及其排列順序或許預(yù)示著這些蛋白質(zhì)存在一種特定的作用機(jī)制。通過(guò)大量的序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn),Cas1似乎是CRISPR位點(diǎn)中最基礎(chǔ)的蛋白質(zhì),因?yàn)樵谒泻蠧RISPR位點(diǎn)的生物種中都發(fā)現(xiàn)了cas1。到目前為止,已有40多種伴隨CRISPR位點(diǎn)的Cas蛋白被鑒定[10]。這些蛋白存在多樣性,有趣的是每一個(gè)CRISPR都含有一個(gè)特異性的CRISPR位點(diǎn)關(guān)聯(lián)的被縮寫為csx(“x”代表亞型的第一個(gè)字母,例如,csy代表Yersina亞型)的基因,因此Haft D H等跟據(jù)該位點(diǎn)對(duì)45種Cas蛋白的攜帶情況,將CRISPR位點(diǎn)分成9種亞型(表1)[15]。由表1可以看出cas1-cas6這六種蛋白廣泛存在于CRISPR亞型中,可以說(shuō)是CRISPR位點(diǎn)的核心蛋白,而其中又?jǐn)?shù)cas1最為常見(jiàn),存在于所有亞型中[11]。但對(duì)于普遍存在于所有亞型中的Cas1蛋白的功能卻存在較大的爭(zhēng)論。Wiedenheft B等從綠膿桿菌中得到的Cas1蛋白有金屬依賴性,dsDNA特異性核酸內(nèi)切酶功能,而Han D H等從Sulpholobus solfataricus中得到的Cas1蛋白卻表現(xiàn)為序列非特異性、多位點(diǎn)、高親合力的核酸結(jié)合蛋白的功能[12-14]。
在自然界中,微生物可以說(shuō)無(wú)處不在。當(dāng)細(xì)菌存在于較為惡劣的環(huán)境中時(shí),它該如何抵御外界的干擾呢?從地球上開(kāi)始有生物至今,在長(zhǎng)期的自然選擇壓力作用下,這些微生物得以進(jìn)化,使其能在自然選擇的壓力下存活。在這個(gè)漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中,它們形成了許多用于保護(hù)自己的,幾乎接近完美的功能性系統(tǒng)。這些功能性系統(tǒng)能使其從其他微生物或環(huán)境中獲得對(duì)自己有利的基因,例如基因盒-整合子系統(tǒng)(integron-cassette system)能使細(xì)菌從其他供體菌中獲得用來(lái)抵抗環(huán)境中對(duì)應(yīng)藥物的耐藥基因;但同時(shí)也存在另外一些系統(tǒng)限制這種過(guò)程的發(fā)生,一般來(lái)說(shuō)是限制對(duì)自己有害的基因進(jìn)入自身,從而達(dá)到保護(hù)自身的目的,例如許多革蘭陽(yáng)性及革蘭陰性菌中的表面排拆(surface exclusion)功能,它能從分子水平降低受體菌的接受能力,從而降低自身對(duì)有害的基因片段的接受能力[16]。
表1 Cas蛋白亞型的分類Table 1 Classification of Cas protein subtypes
在這些自我保護(hù)系統(tǒng)中,CRISPR系統(tǒng)亦是其中之一。最早人們對(duì)CRISPR系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)是通過(guò)對(duì)噬菌體的研究發(fā)現(xiàn),噬菌體是細(xì)菌最為常見(jiàn)的入侵者(invader),為了抵御噬菌體的入侵,即在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中細(xì)菌形成了用于抵抗噬菌體入侵的CRISPR系統(tǒng),從分子水平來(lái)說(shuō),這個(gè)過(guò)程可分為三個(gè)階段。(1)合并整合形成新間區(qū);(2)表達(dá)加工 CRISPR RNAs(crRNAs);(3)crRNAs干擾入侵的噬菌體[17]。整個(gè)過(guò)程類似于機(jī)體的免疫反應(yīng)過(guò)程,故而此過(guò)程被稱為遺傳記憶(genetic memory)。
當(dāng)細(xì)菌與噬菌體共處于同一環(huán)境中時(shí),噬菌體為了自身生存,必定定植于細(xì)菌表面,然后借助于細(xì)菌DNA復(fù)制的機(jī)制進(jìn)行繁殖。當(dāng)噬菌體DNA進(jìn)入攜帶有CRISPR系統(tǒng)的細(xì)胞膜內(nèi)時(shí),該宿主體內(nèi)的CRISPR相關(guān)蛋白質(zhì)復(fù)合體中類似于Cas1核酸結(jié)合蛋白將會(huì)迅速的介導(dǎo)該復(fù)合體與噬菌體DNA進(jìn)行結(jié)合,然后通過(guò)類似于Cas2核酸內(nèi)切酶功能等蛋白質(zhì)的作用,將該DNA切割成17bp~84bp不等的核酸小片段,然后在相關(guān)蛋白的作用下,將其中的一個(gè)小片段整合至前導(dǎo)區(qū)與第一個(gè)重復(fù)之間形成一個(gè)新的間區(qū)(圖2A)。通過(guò)這樣一個(gè)過(guò)程,CRISPR位點(diǎn)就整合進(jìn)了一個(gè)新的間區(qū)。這就使宿主快速的適應(yīng)環(huán)境中的入侵者,因此我們也可以將這個(gè)階段稱為適應(yīng)(Adaptation)階 段。Bolotin A 等[18]研 究 發(fā) 現(xiàn),CRISPR位點(diǎn)中間區(qū)的個(gè)數(shù)與宿主對(duì)噬菌體的敏感性呈負(fù)相關(guān)。進(jìn)而Barrangou R等利用噬菌體去攻擊至少含有一個(gè)CRISPR位點(diǎn)的嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus),最終在前導(dǎo)序列及第一個(gè)重復(fù)間區(qū)找到一個(gè)新的間區(qū),而且變異株對(duì)該噬菌體的敏感性降低,證明了該位點(diǎn)具有抵御外源DNA片段的入侵的功能[19-20]。在序列分析中,有些序列來(lái)源于細(xì)菌質(zhì)粒,證明CRISPR位點(diǎn)也能從質(zhì)粒上獲得新的間區(qū)。
當(dāng)新的間區(qū)穩(wěn)定地存在于CRISPR位點(diǎn)后,間區(qū)所包含的信息將通過(guò)CRISPR途徑來(lái)保護(hù)宿主不受特定的核酸攻擊。然而要實(shí)現(xiàn)這樣一個(gè)途徑,最基本的就是要將間區(qū)加工處理以形成較小的crRNAs。CRISPR的轉(zhuǎn)錄首先在閃爍古球菌(Archaeoglobusfulgidus)中被發(fā)現(xiàn)[21]。此研究表明位點(diǎn)中的轉(zhuǎn)錄首先從前導(dǎo)序列的末端開(kāi)始,也就是說(shuō)在前導(dǎo)序列的末端可能含有CRISPR啟動(dòng)子(CRISPR promoter),從啟動(dòng)子開(kāi)始轉(zhuǎn)錄,重復(fù)序列和間區(qū)先被轉(zhuǎn)錄成前體物RNA(precursor RNA;pre-crRNA)。此時(shí)核心蛋白Cas1-Cas4將會(huì)共同形成一個(gè)復(fù)合物,這個(gè)復(fù)合物將pre-crRNA從特異性位點(diǎn)上(此特異性位點(diǎn)具體何在尚不清楚,有報(bào)道表明在間區(qū)的約第8個(gè)堿基處,但也有報(bào)道稱在重復(fù)序列上)剪切成更小的crRNA,隨后較小的crRNA與蛋白質(zhì)形成具有特殊功能的復(fù)合物crRNP(crRNA-Cas ribonucleoprotein)[22](圖2B)。
當(dāng)宿主再次接觸到環(huán)境中的噬菌體或是質(zhì)粒時(shí),crRNP將會(huì)迅速地通過(guò)核酸結(jié)合蛋白與進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的外源核酸特異性結(jié)合,這種特異性是由新整合進(jìn)入間區(qū)所存貯的信息決所決定。然后在核酸內(nèi)切酶的作用下,將目標(biāo)核酸從3′端開(kāi)始剪切成適合長(zhǎng)度(大約為18bp)的小片段,致使目標(biāo)核酸無(wú)法形使它的功能,噬菌體復(fù)制失敗,質(zhì)粒轉(zhuǎn)移失敗,從而達(dá)到保護(hù)宿主的目的(圖2C)。
通過(guò)以上三個(gè)階段,CRISPR位點(diǎn)行使了它具有的功能。然而它仍然面臨所有生理反應(yīng)所面臨的問(wèn)題,即如何識(shí)別自身與非自身核酸,從而避免發(fā)生“自身免疫”。在CRISPR位點(diǎn)中,新間區(qū)所攜帶的與crRNA仍然存在著對(duì)應(yīng)的關(guān)系。最近一項(xiàng)研究表明,crRNP在體外試驗(yàn)中,能夠區(qū)別目標(biāo)核酸與非目標(biāo)核酸[23],可能是因crRNP中的crRNA與目標(biāo)核酸存在對(duì)應(yīng)的配對(duì)關(guān)系,從而能準(zhǔn)確的識(shí)別目標(biāo)核酸。
到目前為止,CRISPR位點(diǎn)在很多細(xì)菌中都有發(fā)現(xiàn)。這樣普遍的存在于細(xì)菌及古細(xì)菌中,證明該位點(diǎn)對(duì)于細(xì)菌的生存進(jìn)化有著舉足輕重的作用。通過(guò)進(jìn)一步深入的研究,探明該位點(diǎn)的作用機(jī)制,將使我們對(duì)微生物的認(rèn)識(shí)更加深入。一方面,通過(guò)該位點(diǎn)的間區(qū)序列差異,理論上可以推論該細(xì)菌在進(jìn)化過(guò)程的某些細(xì)節(jié)。另一方面,通過(guò)目前對(duì)于該位點(diǎn)的研究,如果能將該位點(diǎn)通過(guò)分子生物學(xué)方法,整合進(jìn)入工程質(zhì)粒,然后應(yīng)用于工業(yè)細(xì)菌中,例如食物產(chǎn)品及大規(guī)模發(fā)酵等領(lǐng)域,將會(huì)給食品安全帶來(lái)一個(gè)革命性的轉(zhuǎn)折。另外,利用該位點(diǎn)的干擾功能,我們亦可在其中引入某種內(nèi)源性基因的間區(qū),然后將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主,或許可以達(dá)到基因沉默的目的,但這一點(diǎn)尚沒(méi)有試驗(yàn)證明。此外,CRISPR位點(diǎn)既然能抵御外源基因的入侵,那么由可移動(dòng)元件介導(dǎo)的耐藥基因在細(xì)菌的的傳播過(guò)程是否也能被這種機(jī)制所抑制呢?關(guān)于這一點(diǎn)尚待試驗(yàn)證明[24]。如果該位點(diǎn)對(duì)于某些耐藥性質(zhì)粒或是耐藥基因,也能達(dá)到沉默的目的,那么,通過(guò)對(duì)該位點(diǎn)的克隆、轉(zhuǎn)化,將會(huì)使全球性的耐藥問(wèn)題得以緩解。
總之,介于該位點(diǎn)中已知的作用機(jī)制和有待試驗(yàn)證明的未知的作用機(jī)制,該位點(diǎn)對(duì)于我們對(duì)微生界的認(rèn)識(shí)都有十分顯著的作用。因此,對(duì)于CRISPR位點(diǎn)的研究,具有無(wú)可比擬的重要性。
[1]Asakura Y,Kojima H,Kobayashi I.Evolutionary genome engineering using a restriction-modification system [J].Nucleic Acids Res,2011,39(20):9034-9046.
[2]Ishino Y,Shinagawa H,Makino K,et al.Nucleotide sequence of the iap gene,responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion inEscherichiacoli,and identification of the gene product[J].J Bacteriol,1987,169(12):5429-5433.
[3]Mojica F J,F(xiàn)errer C,Juez G,et al,Long stretches of short tandem repeats are present in the largest replicons of the ArchaeaHaloferaxmediterraneiandHaloferaxvolcaniiand could be involved in replicon partitioning[J].Mol Microbiol,1995,17(1):85-93.
[4]Hermans P W,van Soolingen D,Bik E M,et al.Insertion element IS987from Mycobacterium bovis BCG is located in a hot-spot integration region for insertion elements inMycobacteriumtuberculosiscomplex strains[J].Infect Immun,1991,59(8):2695-2705.
[5]Klenk H P,Clayton R A,Tomb J F,et al.The complete genome sequence of the hyperthermophilic,sulphate-reducing archaeonArchaeoglobusfulgidus[J].Nature,1997,390(6658):364-370.
[6]Kawarabayasi Y,Hino Y,Horikawa H,et al.Complete genome sequence of an aerobic hyper-thermophilic crenarchaeon,AeropyrumpernixK1[J].DNA Res,1999,6(2):83-101,145-152.
[7]Jansen R,Embden J D,Gaastra W,et al.Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes[J].Mol Microbiol,2002,43(6):1565-1575.
[8]Grissa I,Vergnaud G,Pourcel C.The CRISPRdb database and tools to display CRISPRs and to generate dictionaries of spacers and repeats[J].BMC Bioinformatics,2007,8(172):1-10.
[9]Heidelberg J F,Nelson W C,Schoenfeld T,et al.Germ warfare in a microbial mat community:CRISPRs provide insights into the coevolution of host and viral genomes[J].PLoS one,2009,4(1):e4169.
[10]Hale C R,Zhao P,Olson S,et al.RNA-guided RNA cleavage by a CRISPR RNA-Cas protein complex[J].Cell,2009,139(5):945-956.
[11]Haft D H.,Selengut J,Mongodin E F,et al.A guild of 45 CRISPR-associated(Cas)protein families and multiple CRISPR/Cas subtypes exist in prokaryotic genomes[J].PLoS Comput PLoS Comput Biol,2005,1(6):e60.
[12]Wiedenheft B,Zhou K,Jinek M,et al.Structural basis for DNase activity of a conserved protein implicated in CRISPR-medi-ated genome defense[J].Structure,2009,1(6):904-912.
[13]Han D,Lehmann K,Krauss G.SSO1450—a CAS1protein fromSulfolobussolfataricusP2with high affinity for RNA and DNA [J].FEBS Lett,2009,583(12):1928-1932.
[14]Jore M M,Lundgren M,van Duijn E,et al.Structural basis for CRISPR RNA-guided DNA recognition by Cascade [J].Nat Struct Mol Biol,2011,18(5):529-536.
[15]Marraffini L A,Sontheimer E J.CRISPR interference:RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea [J].Nat Rev Genet,2010,11(3):181-190.
[16]Possoz C,Gagnat J,Sezonov G,et al.Conjugal immunity ofStreptomycesstrains carrying the integrative element pSAM2is due to the pif gene(pSAM2immunity factor)[J].Mol Microbiol,2003,47(4),1385-1393.
[17]van der Oost J,Jore M M.,Westra E R,et al.CRISPR-based adaptive and heritable immunity in prokaryotes[J].Trends Biochem Sci,2009,34(8):401-407.
[18]Bolotin A,Quinquis B,Sorokin A,et al.Clustered regularly interspaced short palindrome repeats(CRISPRs)have spacers of extrachromosomal origin[J].Microbiology,2005,151(Pt8):2551-2561.
[19]Barrangou R,F(xiàn)remaux C,Deveau H,et al.CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes[J].Science,2007,315(5819):1709-1712.
[20]Tang T H,Bachellerie J P,Rozhdestvensky T,et al.Identification of 86candidates for small non-messenger RNAs from the archaeonArchaeoglobusfulgidus[J].Proc Natl Acad Sci USA,2002,99(11):7536-7541.
[21]Kunin V,Sorek R,Hugenholtz P.Evolutionary conservation of sequence and secondary structures in CRISPR repeats[J].Genome Biol,2007,8(4):R61.
[22]Marraffini L A,Sontheimer E J.Self versus non-self discrimination during CRISPR RNA-directed immunity[J].Nature,2010,463(7280):568-571.
[23]Horvath P,Barrangou R.CRISPR/Cas,the immune system of bacteria and archaea[J].Science,2010,327(5962):167-170.
[24]Palmer K L,Gilmore M S.Multidrug-resistant enterococci lack CRISPR-cas[J].MBio,2010,1(4):pii:e00227-10.