四氫小檗紅堿及其前藥的比格犬藥代動力學研究

彭真珍，原 梅，溫 泉，李 樺，趙春杰，楊 征

(1.軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所，北京 100850;2.沈陽藥科大學，遼寧沈陽 110016;3.軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所，北京 100850)

焦慮癥(anxiety disorder)是一種以持續(xù)性的焦慮、緊張或反復性發(fā)作的驚恐不安等情緒為主的神經癥，主要表現(xiàn)為病人充滿了長久的(持續(xù)在6個月以上)、過度的、模糊的、不明原因的焦慮和擔心，并伴有自主神經紊亂、肌肉緊張及運動不安等癥狀。近年來隨著經濟發(fā)展、生活節(jié)奏加快和社會競爭的激烈，焦慮癥患者的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢。抗焦慮藥(anxiolytics)是主要用以減輕焦慮、緊張、恐懼、穩(wěn)定情緒，兼有鎮(zhèn)靜催眠作用的藥物。應用抗焦慮藥是臨床上治療焦慮癥的重要方法，目前常用的抗焦慮藥主要有苯二氮艸卓類藥物、5-HT1A部分激動劑、選擇性5-HT再攝取抑制劑以及其他新型抗焦慮藥等［1－2］。此外，長期應用某些抗抑郁藥也能起到抗焦慮作用，如阿米替林和文拉法辛等。但是，這些藥物在臨床應用中均存在諸如作用廣泛、不良反應較多、起效緩慢等問題。因此，研究藥效好、副作用低的抗焦慮藥物依然是社會公共心理衛(wèi)生的迫切需求，已成為神經系統(tǒng)藥物的研發(fā)熱點。

四氫小檗紅堿(THB)是小檗堿的衍生物之一，代號為BJ236-1。前期藥理學研究發(fā)現(xiàn)，THB具有較好的抗焦慮效應，且無中樞興奮或抑制作用［3］，因此有望成為抗焦慮的候選藥物。但由于THB的水溶性較差，口服生物利用度很低，不利于開發(fā)成為口服藥物。為了改善THB的成藥性，通過生物轉化的方法在THB的9位羥基上乙?；玫狡淝八?-乙酰四氫小檗紅堿硫酸鹽(ATHBS)。早期藥代性質評價結果顯示，與THB相比，ATHBS在動物體內的吸收明顯改善，前藥在體內能很快釋放出活性成分THB，明顯提高了THB口服生物利用度，這些特點表明ATHBS是具有一定開發(fā)前景的藥物候選物。為了評價THB及其前藥的體內處置和藥代動力學性質，本文首次建立了同時檢測比格犬全血中ATHBS及THB濃度的LC-MS/MS方法，并研究了比格犬口服和靜注ATHBS后前藥和THB的藥代動力學及口服生物利用度，為ATHBS的進一步開發(fā)和臨床研究提供必要的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥品和試劑THB(Fig 1)和ATHBS標準品，純度＞99%，由軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所提供(中國藥科大學中藥學院中藥復方研究室合成)。鹽酸小檗堿(BR)，純度＞98%，購自中檢所;乙腈(色譜純)為Fisher公司產品，甲酸、甲酸銨和氫氧化鈉均為分析純。

Fig 1 Chemical structure of THB

1.2儀器Agilent UHPLC 1290液相色譜系統(tǒng)，包括二元輸液泵(G4220A)、自動進樣器(G4226A)、柱溫箱(G1316C)。Agilent 6410三重四級桿串聯(lián)質譜，配備電噴霧離子源(ESI)以及數(shù)據(jù)采集軟件MassHunter B.04.00。高速低溫離心機(美國Thermo公司)。

1.3比格犬藥代動力學試驗健康♂比格犬5只，體質量為(10±2)kg，由軍事醫(yī)學科學院動物中心提供，動物許可證號SCXK-(軍)2007-004。動物隨機編號并稱重，采用雙周期自身交叉實驗設計，按3 mg·kg－1劑量給藥。比格犬口服給藥前12h禁食，自由飲水。ATHBS給藥溶液用生理鹽水配制，口服組以1 ml·kg－1的體積灌胃;靜注組以 0.5 ml·kg－1的體積前肢靜注給藥。口服組于給藥前和給藥后5、10、15、30 min、1、2、4、6、8、12 和 24 h 采血約200 μl，靜注組于給藥前和給藥后 2、5、15、30 min、1、2、4、6、8、12 和 24 h 采血約 200 μl。兩組試驗之間凈化期為7 d。

1.4LC-MS/MS分析條件取比格犬新鮮全血100 μl，立即加入到提前放置于冰浴的 400 μl乙腈中(含100 μg·L－1內標)，渦旋60 s，4℃，18 800 ×g離心10 min，取上清液400 μl于－20℃凍存待測。樣品測定前再次4℃、18 800×g離心10 min。色譜柱為 Eclipse Plus C18柱(4.6 mm ×100 mm，3.5 μm，Agilent，USA);流動相為水(含0.1%甲酸，5 mmol·L－1甲酸銨)-乙腈(含0.1%甲酸);梯度洗脫程序為0～2 min 35%B，2～3 min 90%B，3～3.5 min 90%B，3.5～4 min 35%B，4～5 min 35%B;流速為0.6 ml·min－1;柱溫 30 ℃;進樣體積 2 μl;總洗脫時間為5 min。質譜條件:離子源為ESI，正離子模式檢測;多反應監(jiān)測(MRM)掃描方式定量;毛細管電壓3 800 V;源溫度為350℃;霧化氣(NEB)為40 psi;用于定量分析的離子對分別為:ATHBS m/z 368→ m/z 176.1，THB m/z 326→ m/z 176.1 和 BR m/z 336.3→ m/z 320.1。

1.5方法學驗證用采自6條犬的混合空白犬血90 μl加入10 μl系列濃度的ATHBS和THB 混合工作液，配制濃度范圍為 2 ～2 000 μg·L－1的標準曲線樣品，按“1.4”描述的方法處理樣品并測定，得到方法的線性范圍和最低定量限。另配制濃度為5、100、1 500 μg·L－1的 ATHBS 和 THB 的混合質控樣品各5份，連續(xù)3 d，每日測定5次，用隨行標準曲線計算相應的藥物濃度，分別計算批內和批間的精密度與準確度。在3個質控濃度水平，以全血加標樣品的峰面積與標準溶液的峰面積之比，計算方法的回收率。另取空白血樣按“1.4”描述的方法處理，得到提取后的空白樣品，以提取后空白加標樣品的峰面積與流動相加標樣品的峰面積之比，計算基質效應。在低、中和高3個質控濃度水平，考察了ATHBS和THB的處理樣品在4℃放置24 h，冰浴放置2 h以及－20℃放置不同天數(shù)的穩(wěn)定性。

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析THB的血藥濃度－時間曲線用WinNonlin軟件(Version 5.2.1，美國)的非房室模型進行擬合，得到藥代動力學參數(shù)。Cmax為實測的最大血藥濃度，Tmax為口服給藥后血藥濃度達峰時間為藥物末端消除半衰期，MRT為藥物在體內平均滯留時間，血藥濃度－時間曲線下面積AUC(0-t)由梯形法計算得到，Vd為穩(wěn)態(tài)時表觀分布容積，CL為清除率。絕對生物利用度計算公式如下:

2 結果

2.1LC-MS/MS定量方法學驗證本研究全面考察了LC-MS/MS同時定量檢測犬血中THB和ATHBS的方法學。Fig 2是空白、空白加標和實際血樣的MRM色譜圖，血樣中的內源性物質不干擾待測物和內標的測定，THB、ATHBS和內標的保留時間分別為2.52、3.07和3.90 min。THB和 ATHBS的標曲在2～2 000 μg·L－1的范圍內呈良好的線性關系(r＞0.9985)，二者的定量下限均為 2 μg·L－1。THB和ATHBS低、中和高3個濃度的回收率分別大于78.74%和75.52%;全血基質對THB和ATHBS測定的影響很小，二者的基質效應分別在94.59%～98.91%和100.81%～108.85%的范圍內。THB和ATHBS的日內和日間精密度(RSD)分別＜10.79%和＜6.57%，準確度(RE)在－10.30%～3.92%的范圍內，符合新藥臨床前藥代動力學研究生物樣品定量分析的要求，結果分別見Tab 1，2。在現(xiàn)行條件下，THB和ATHBS的低、中和高3個濃度在全血前處理樣品中4℃放置24 h，冰浴放置2 h以及－20℃放置27 d的穩(wěn)定性也符合要求，實測濃度與配制濃度之間的相對誤差(RE)分別＜11.68%和11.13%。上述結果表明，本文建立的同時定量測定犬血中THB和ATHBS的LC-MS/MS方法的專一性、重現(xiàn)性和靈敏度均符合臨床前藥代動力學樣品分析的要求，可以用于比格犬藥代動力學研究。

Tab 1 Intra-and inter-day precisions and accuracies of THB in dog blood(±s)

Tab 1 Intra-and inter-day precisions and accuracies of THB in dog blood(±s)

Nominal Conc/μg·L －1 Inter-day(n=5)Measured Conc/μg·L －1RSD/% RE/%Intra-day(n=15)Measured Conc/μg·L－1RSD/% RE/%5 4.48 ±0.18 3.91 －10.30 5.06 ±0.55 10.79 1.26 100 102.10 ±0.82 0.80 2.10 101.78 ±7.43 7.30 1.78 1500 1 558.80 ±22.34 1.43 3.92 1 511.86 ±59.52 3.94 0.79

Tab 2 Intra-and inter-day precisions and accuracies of ATHBS in dog blood(±s)

Tab 2 Intra-and inter-day precisions and accuracies of ATHBS in dog blood(±s)

Nominal Conc/μg·L －1 Inter-day(n=5)Measured Conc/μg·L －1RSD/% RE/%Intra-day(n=15)Measured Conc/μg·L－1RSD/% RE/%5 4.79 ±0.11 2.38 －4.26 4.90 ±0.32 6.57 －1.93 100 101.00 ±1.37 1.35 1.00 101.50 ±4.42 4.36 1.50 1 500 1 543.05 ±26.48 1.72 2.87 1 511.76 ±41.50 2.75 0.78

Fig 2 Representative MRM chromatograms of(A)blank blood sample，(B)blank sample spiked with THB，ATHBS and IS，(C)Beagle dog blood sample collected at 10 min after oral administration of 3 mg·kg－1ATHBS

2.2比格犬靜注和口服藥代動力學采用雙周期自身交叉實驗設計研究了比格犬靜注和口服ATHBS(3 mg·kg－1)后全血中前藥和THB的藥代動力學和口服生物利用度。比格犬靜注ATHBS后2 min時的平均血濃度為(144.17±39.30)μg·L－1，隨之血中濃度快速下降，所有受試犬給藥1 h后ATHBS血濃度均低于檢測限?？诜o藥后5～30 min，ATHBS的血濃度波動很大，犬之間的個體差異也較大，30 min后大多數(shù)比格犬ATHBS的血濃度低于檢測限。靜注和口服后均未能得到完整的ATHBS藥代動力學曲線。

Tab 3 Pharmacokinetic parameters of THB in Beagle dogs after oral or intravenous administration of 3 mg·kg－1ATHBS(±s，n=5)

Tab 3 Pharmacokinetic parameters of THB in Beagle dogs after oral or intravenous administration of 3 mg·kg－1ATHBS(±s，n=5)

Parameter Unit iv Oral T 7.03 ±1.77 5.89 ±3.95 AUC(0-t) μg·h·L－1 718.64 ±143.01 179.62 ±91.64 AUC(0-∞) μg·h·L－1 778.57 ±162.73 203.95 ±97.10 Tmax h － 0.23 ±0.04 Cmax μg·L－1 605.99 ±102.88 77.71 ±26.60 Vd L·kg－1 39.15 ±5.07 －CL ml·min－1·kg－166.65 ±14.81 －MRT(0-t) h 4.26 ±1.40 5.62 ±1.88 F 12 h%26.2

Fig 3 Mean blood concentration-time profiles of THB in Beagle dogs after oral and intravenous administrations of 3 mg·kg－1ATHBS(±s，n=5)

比格犬靜注和口服ATHBS后活性成分THB的平均血藥濃度－時間曲線見Fig 3。以非房室模型進行擬合得到的主要藥代動力學參數(shù)，見Tab 3。比格犬口服和靜注ATHBS后在血中可迅速轉化成活性代謝產物THB，靜注組的THB血藥濃度在第1個采樣點(2 min)即達到(605.99±102.88)μg·L－1的峰值，隨后血藥濃度呈雙相下降，平均消除半衰期為7.03h?？诜M的THB血藥濃度出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，第1個峰值出現(xiàn)在 15min左右，Cmax的均值為(77.71±26.60)μg·L－1，第2 個小峰出現(xiàn)在給藥后6 h，平均血藥濃度為(16.43±15.05)μg·L－1。隨后血藥濃度的下降與靜注組相似，平均消除半衰期為5.89 h，與靜注組相比差異無顯著性。以比格犬血中的THB暴露(AUC)計算得到口服給藥的絕對生物利用度為26.2%。

3 討論

本研究首次建立了同時測定比格犬全血中ATHBS和THB的LC-MS/MS方法，該方法專屬性強，靈敏度高，可同時定量分析前藥和活性代謝產物。此方法不僅已用于比格犬藥代動力學的研究，也易于推廣至其它臨床前動物或人體試驗。在方法建立初期發(fā)現(xiàn)，ATHBS結構中含有酯鍵，易被血漿中的酯酶水解，在全血和血漿中極不穩(wěn)定。如果按照常規(guī)方法分離血漿或取全血后批次處理血樣本，ATHBS在處理過程中就會部分發(fā)生降解，生成THB，因而不能準確反映前藥和活性產物在生物體內的實際濃度。經反復實驗，最終確定采集全血后立即加入預先冰冷的乙腈，終止酯酶水解反應并沉淀蛋白，隨后低溫離心分離以阻止全血中酯酶對藥物的進一步轉化作用。方法學驗證的結果表明，前處理方法簡便可行，解決了前藥在試管中可能轉化為活性產物、導致血藥濃度檢測出現(xiàn)假象的問題。

比格犬單次靜注和口服給予ATHBS后，在全血中能迅速轉化成活性代謝產物THB?？诜MTHB達峰迅速，體內吸收過程近似于靜脈給藥，但整體血藥濃度低于靜注組，這可能與口服組的THB在經ATHBS轉化的同時在體內經歷進一步的肝腸代謝有關。體外研究結果表明，THB在肝微粒體中能較快代謝轉化，形成其它氧化代謝產物(未發(fā)表結果)。靜注組前藥的血藥濃度很快降至定量檢測限之下，而THB的血藥濃度在首個采樣點即達到峰值，幾乎沒有滯后期，表明前藥的體內行為符合設計要求，明顯改善了活性成分的吸收，THB是血循環(huán)中的主要成份并發(fā)揮藥理作用。THB的靜注清除率(CL)為(66.65 ±14.81)ml·min－1·kg－1，遠遠高于比格犬的肝臟血漿流量(30 ml·min－1·kg－1)［4］，提示其體內首過效應較強。穩(wěn)態(tài)分布容積(Vd)為(39.15 ±5.07)L·kg－1，遠遠高于比格犬的全身水含量(0.6 L·kg－1)［4］，提示藥物有廣泛的血管外組織分布。雖然口服前藥后THB的血藥濃度在比格犬體內消除較快，但其口服生物利用度為26.2%，與THB直接給藥相比有明顯提高。

口服ATHBS后THB在體內也較快達峰，并在6h左右二次達峰，而靜脈注射未見此現(xiàn)象。文獻報道，口服小檗堿不僅能對抗和抑制感染，而且還發(fā)現(xiàn)其具有阻斷胃腸道平滑肌α受體的作用，從而減慢胃腸道蠕動［5］。此外，小檗堿的藥代動力學研究結果表明，動物和人口服小檗堿后均出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象［6－7］，因此小檗堿及其衍生物THB對胃腸道蠕動的減慢是可能造成雙峰或多峰現(xiàn)象的原因之一［8］，可考慮在后期研究中同時給予咖啡因等促進腸道蠕動的藥物，觀察對THB雙峰現(xiàn)象的影響。

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