在線固相萃?。嘿|(zhì)聯(lián)用法定量分析生物基質(zhì)中丁香醛及其在大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)研究中的應(yīng)用

王允吉，王清清，楊志暉，楊 杰，關(guān) 華，周平坤，宋海峰

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽合肥 230032;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850)

香蘭素又名香草醛(結(jié)構(gòu)見Fig 1)，其具有特殊香氣，作為食品添加劑被廣泛使用。近年來，香蘭素在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用與研究也受到了關(guān)注，多應(yīng)用于慢性疼痛和神經(jīng)性疼痛［1］，也有報道稱香蘭素能抑制X射線和紫外線誘導(dǎo)的染色體畸變，但香蘭素抗輻射作用濃度相對較高，活性較低［2－3］。研究人員篩選出抗輻射作用更好的香蘭素衍生物丁香醛(結(jié)構(gòu)見Fig 2)，前期藥效學(xué)結(jié)果顯示♂BALB/C小鼠照射前灌胃給予丁香醛混懸液(給藥劑量10，50，100 mg·kg－1)，均能有效地降低小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率和染色體畸變率，同時提高骨髓有絲分裂指數(shù)，對60Co γ射線誘發(fā)的小鼠骨髓損傷有良好的保護(hù)作用［4］。因此，丁香醛具有發(fā)展成為新型輻射防護(hù)藥物的價值。為了闡明其藥代動力學(xué)特性，需建立針對生物樣品中丁香醛的定量分析方法。本研究根據(jù)丁香醛的結(jié)構(gòu)特點及理化性質(zhì)建立了一種快速、特異、靈敏和準(zhǔn)確的在線固相萃取－液質(zhì)聯(lián)用方法(on-line SPE LC-MS/MS)，并將驗證后的方法應(yīng)用于大鼠體內(nèi)丁香醛的初步藥代動力學(xué)研究中。

1 材料

1.1儀器API 4000型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源以及Analyst 1.5數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國Applied Biosystem公司);島津SIL-20AC型高效液相色譜輸液泵和自動進(jìn)樣器(日本SHIMADZU公司)。On-line SPE HPLC-MS/MS裝置為實驗室自行搭建［5－7］，裝置工作原理見Fig 3。固相萃取柱的出口連接至切換閥，其兩個出口通過切換閥的切換功能，可分別連接廢液瓶(Waste)和分析柱。轉(zhuǎn)動切換閥切換至Fig 3中(A)位置，固相萃取柱和反相分析柱各自獨立，固相萃取柱平衡后，血漿樣品進(jìn)入固相萃取柱，經(jīng)大流速流動相萃取和沖洗;轉(zhuǎn)動切換閥至Fig 3中(B)位置，固相萃取柱和反相分析柱成串聯(lián)狀態(tài)，待測組分經(jīng)洗脫后從分析柱分離進(jìn)入質(zhì)譜儀檢測。

Fig 1 The structure of vanillin

Fig 2 The structure of syringaldehyde

Fig 3 The configuration of on-line SPE HPLC-MS/MS system

1.2試劑丁香醛對照品(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院二所七室提供，批號:20100316，純度為99.5%，4℃保存);香蘭素對照品(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院二所七室提供，批號:20100409，純度為99.5%，4℃保存);乙腈(Merck公司，色譜純)，甲酸(北京化學(xué)試劑公司，分析純)。實驗用水為Millipore Synergy UV純水儀制備的超純水。

1.3動物健康SD大鼠4只(清潔級)，♂♀各半，2月齡，體質(zhì)量(200±20)g，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供(許可證號:SCXK-［軍］2007-004)。單籠飼養(yǎng)，12 h晝夜節(jié)律照明，實驗期間自由飲水。

2 方法

2.1 HPLC-MS/MS條件液相條件:分析柱:Alltima HP C18 柱(50 mm ×2.1 mm，5 μm)，在線固相萃取柱:Alltech公司不銹鋼柱(50 mm×2.1 mm)，固相萃取柱填料(Zobax球形填料，40 μm ～60 μm粒徑)，分析柱流動相:乙腈－0.1%甲酸(60∶40，V∶V)，流速:0.4 ml·min－1;固相萃取柱流動相為乙腈－0.1%甲酸，流速為3.0 ml·min－1;進(jìn)樣量為10 μl;流動相梯度程序見Tab 1。

質(zhì)譜條件:API 4000離子噴射電壓為4500 V;溫度 450℃;離子源氣體 1(N2)壓力為 45 p.s.i，離子源氣體2(N2)壓力為 60 p.s.i，氣簾氣體(N2)壓力為 20 p.s.i，碰撞氣壓力為 6 p.s.i;去簇電壓(DP)為50 V;碰撞能量(CE)為52 V;掃描時間均為0.2 s。正離子方式檢測;掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);用于定性的離子反應(yīng)為m/z 183.2→m/z 155.0(丁香醛)，用于定量分析的離子反應(yīng)分別為m/z 183.2→m/z 123.1(丁香醛)，m/z 153.1→m/z 93.0(內(nèi)標(biāo)，香蘭素)。

2.2溶液配制精密稱取丁香醛對照品1.0 mg，置于1.5 ml離心管中，用乙腈－水(50∶50，V∶V)配制成1.0 g·L－1的儲備液，取10 μl上述儲備液，加入90 μl的乙腈 － 水(50 ∶50，V∶V)配制0.1 g·L－1的母液A，用乙腈 － 水(50∶50，V∶V)逐級稀釋母液 A 得到系列工作液(200、400、1 000、2 000、4 000、10 000、20 000和40 000 μg·L－1)。按上述方法另配制0.1 g·L－1的丁香醛母液B，用乙腈－水(50∶50，V∶V)稀釋母液B得到質(zhì)控樣品溶液(500、15 000和30 000 μg·L－1)。取香蘭素對照品1.0 mg，置于1.5 ml離心管中，用乙腈－水(50∶50，V∶V)配制成1.0 g·L－1的儲備液，精密量取儲備液適量，用乙腈稀釋成濃度為50 μg·L－1的內(nèi)標(biāo)溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

Tab 1 The procedure of On-line SPE HPLC-MS/MS system

2.3血漿樣品預(yù)處理將樣品在室溫解凍，取30 μl的血漿樣品加入 90 μl冰乙腈(含 50 μg·L－1內(nèi)標(biāo))，渦旋混勻，離心7 min(13 000 r·min－1)，取上清10 μl進(jìn)樣，用于在線提取和分析過程。

2.4動物實驗方法取SD大鼠4只(♀♂各2只)，分為兩組，實驗期間自由飲水。以上述丁香醛劑量(17.5 和70 mg·kg－1)經(jīng)灌胃給藥 0.6 ml，于0 min(給藥前)，1、5、10、15、25、30、45 min，1、1.5、2、2.5、3、4 h 眼眶靜脈叢取血。用 1.09 mol·L－1檸檬酸鈉抗凝管收集血樣，5 000 r·min－1離心10 min，分離血漿，置于－80℃冰箱保存待測。

3 結(jié)果

3.1線性范圍分別取“2.2”項方法配制的系列工作液5 μl加入到95 μl的空白大鼠血漿中，得到濃度為 10、20、50、100、200、500、1 000和2 000 μg·L－1的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，按照“2.3血漿樣品預(yù)處理”項下方法操作，進(jìn)樣10 μl，記錄色譜圖。以丁香醛和內(nèi)標(biāo)香蘭素的峰面積比值為縱坐標(biāo)(Y)，以丁香醛濃度為橫坐標(biāo)(X)，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸運算，權(quán)重系數(shù)為1/x，求得回歸方程為Y=0.00518X+0.0538(r=0.9997)，本方法在 10.0 μg·L－1～2 000 μg·L－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。定量下限為10 μg·L－1。

3.2準(zhǔn)確度和精密度按“3.1”項下方法分別制備低、中、高3個濃度(濃度分別為25、750和1500 μg·L－1)的SD大鼠血漿QC樣品，每一濃度進(jìn)行6樣本分析，連續(xù)測定3 d，根據(jù)當(dāng)日隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計算QC樣品的測得濃度，求得方法的準(zhǔn)確度RE(QC樣品測量均值對真值的相對誤差)與精密度RSD(QC樣品測得值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差)，結(jié)果見Tab 2。本分析方法的日內(nèi)精密度RSD均＜16.3%，日間精密度RSD均＜13.8%，準(zhǔn)確度RE在－8.5% ～5.9%之間，均符合目前生物樣品分析方法指導(dǎo)原則的有關(guān)規(guī)定，該法可用于準(zhǔn)確測定SD大鼠血漿中丁香醛的濃度。

Tab 2 Precision and accuracy of syringaldehyde in Sprague-Dawley rat plasma(n=6)

3.3特異性分別取6個不同個體SD大鼠的空白血漿、空白血漿外加定量下限(10 μg·L－1)的丁香醛樣品，以及SD大鼠給藥后的血漿樣品，按照“2.3血漿樣品預(yù)處理”項下方法操作，結(jié)果顯示血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不會干擾丁香醛和內(nèi)標(biāo)香蘭素的測定。Fig 4是丁香醛大鼠血漿樣品處理后經(jīng)on-line SPE HPLC-MS/MS測定后的結(jié)果。

3.4提取回收率按“3.2”項下所述方法分別制備低、中、高3個濃度(濃度分別為25、750和1 500 μg·L－1)的萃取血漿樣品，每個濃度平行6樣本分析。未萃取血漿樣品分別取上述6個不同個體的空白血漿經(jīng)蛋白沉淀后，用On-line SPE系統(tǒng)收集萃取液，用上述萃取液配制低、中、高3個濃度的QC樣品。提取回收率為萃取血漿樣品的峰面積之比(分析物/內(nèi)標(biāo))與未經(jīng)萃取血漿樣品的峰面積之比(分析物/內(nèi)標(biāo))的比值。結(jié)果表明丁香醛在低、中、高3個濃度QC樣品中的提取回收率分別為(97.2±12.9)%、(116.7±7.7)%和(109.6±8.8)%，可見方法提取回收率良好。

3.5樣品穩(wěn)定性按“3.2”項下方法分別制備低、中、高3個濃度(濃度分別為 25、750 和1 500 μg·L－1)的SD大鼠血漿QC樣品，每個濃度平行制備6樣本，分別在室溫放置12 h、反復(fù)凍(－80℃)融3個循環(huán)，以及QC待進(jìn)樣樣品(經(jīng)樣品預(yù)處理后)在樣品盤中室溫放置8 h，將上述樣品按“2.3血漿樣品預(yù)處理”項下操作，以當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計算QC樣品的測得濃度，與加入濃度進(jìn)行比較，Tab 3分別為丁香醛大鼠血漿樣品在不同條件下的穩(wěn)定性。結(jié)果表明丁香醛大鼠血漿樣品室溫放置12 h，反復(fù)凍融3次，處理后在樣品盤放置8 h條件下均保持穩(wěn)定。

3.6方法的通用性按“3.2”項下方法分別制備低、中、高3個濃度(濃度分別為25、750和1 500 μg·L－1)的獼猴血漿QC樣品，每一濃度進(jìn)行6樣本分析，連續(xù)測定3 d，以當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計算QC樣品濃度，求得方法的準(zhǔn)確度RE與精密度RSD。本分析方法的日內(nèi)精密度RSD均＜8.4%，日間精密度RSD均＜9.9%，準(zhǔn)確度RE在 －10.6% ～7.6%之間，均符合目前生物樣品分析方法指導(dǎo)原則的有關(guān)規(guī)定。故該方法同樣適用于獼猴血漿樣品的檢測，具有一定的通用性。

3.7SD大鼠藥代動力學(xué)參數(shù)SD大鼠灌胃給予丁香醛藥液后取樣測定，通過Origin7.5軟件處理得到的血藥濃度－時間曲線見Fig 5。通過WinNonlin軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用非房室模型統(tǒng)計距方法計算各種藥代動力學(xué)參數(shù)。低、高劑量組的Tmax分別為10.0 min 和 27.5 min;Cmax分別為 361 μg·L－1和944 μg·L－1;消除半衰期分別為41.9 min和54.0 min;CL 分別為 848.1 ml·min－1·kg－1和683.9 ml·min－1·kg－1;AUC0-t分別為 19016.8 μg·min·L－1和 89322.0 μg·min·L－1。

Fig 4 The specific chromatograms of method(1:syringaldehyde;2:IS)

Tab 3 Stability of syringaldehyde in different conditions

Fig 5 Mean plasma concentration-time curve of syringaldehyde in Sprague-Dawley rats after intragastric administration(17.5 mg·kg－1and 70 mg·kg－1，±s)

4 討論

4.1分析條件的優(yōu)化實驗考察了乙腈與不同比例醋酸銨和甲酸水溶液對丁香醛和內(nèi)標(biāo)香蘭素峰形和響應(yīng)值的影響，最終確定分析用流動相為乙腈:0.1%甲酸水溶液(60∶40，V∶V)。文獻(xiàn)報道［1］選用C8柱(100 mm ×2.1 mm，5 μm)可以獲得較好的峰形和分離度，但是分析時間較長，本實驗選用Alltima HP C18 柱(50 mm ×2.1 mm，5 μm)作為分析柱，不僅峰形良好且縮短了分析時間，整個分析周期僅為5 min。

在ESI源正離子模式下對丁香醛和內(nèi)標(biāo)香蘭素進(jìn)行Q1全掃描，丁香醛和內(nèi)標(biāo)香蘭素的分子離子峰［M+H］+分別為 m/z 183.2和 m/z 153.1，選擇其作為母離子進(jìn)行碎片離子掃描，丁香醛和內(nèi)標(biāo)香蘭素的主要碎片離子分別為 m/z 123.1和m/z 93.0，故選二者主要離子對m/z 183.2→m/z 123.1和m/z 153.1→m/z 93.0為MRM分析的定量離子對。采用MRM較選擇離子監(jiān)測方式(SRM)具有更高的專屬性和靈敏度。

4.2樣品前處理方法的選擇由于血漿中內(nèi)源性基質(zhì)較為復(fù)雜，在樣品分析過程中隨著進(jìn)樣次數(shù)的增多系統(tǒng)壓力增高而損壞分析柱，同時會造成靈敏度下降。目前蛋白沉淀法是生物樣品前處理最常用的方法［8－10］。On-line SPE HPLC-MS/MS 系統(tǒng)是本實驗室自行搭建的一套樣品前處理和樣品定量分析于一體的在線裝置，可以實現(xiàn)高通量樣品分析，在樣品制備過程中能有效的去除雜質(zhì)，提高分析柱使用壽命。針對丁香醛，分別優(yōu)化了上樣體積、上樣溶劑、活化溶劑及時間，最終選擇乙腈為活化溶劑，活化時間為2 min，水為上樣試劑，時間為3 min(見Tab 1)。文獻(xiàn)報道香蘭素［1］和丁香酚［11－13］均采用蛋白沉淀后進(jìn)行丹酰氯衍生化反應(yīng)，采用LC-MS/MS法檢測。雖然靈敏度較高，但是樣品的處理過程繁瑣耗時，且易引入衍生化反應(yīng)的副產(chǎn)物。對比文獻(xiàn)報道丁香酚［12］在SD大鼠血漿中的定量下限20 μg·L－1，本研究建立的方法更加靈敏，且分析時間較短，更適合高通量樣品檢測。

本研究對丁香醛在SD大鼠血漿中定量分析方法進(jìn)行了優(yōu)化，建立了SD大鼠血漿樣品中丁香醛的on-line SPE LC-MS/MS定量分析方法，并進(jìn)行了嚴(yán)格的方法學(xué)確證。確證后的方法被應(yīng)用于SD大鼠體內(nèi)丁香醛的初步藥代動力學(xué)研究中。結(jié)果表明，本研究建立的生物基質(zhì)中丁香醛的on-line SPE LC-MS/MS定量分析方法較文獻(xiàn)報道方法更為快速靈敏，適用于丁香醛在SD大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究。且本方法的適用性廣泛，有望應(yīng)用于后續(xù)臨床前和臨床藥代動力學(xué)和相關(guān)定性和定量分析研究中。

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