鹽酸阿霉素殼聚糖納米粒大鼠鼻腔給藥的腦內(nèi)藥動學研究

王叢瑤，鄭杭生，谷滿倉，陳蘋蘋，金 滔，李范珠

(浙江中醫(yī)藥大學藥學院，浙江杭州 310053)

鹽酸阿霉素(adriamycin hydrochloride，ADM)屬蒽環(huán)類抗腫瘤抗生素，具有抗癌譜廣、活性強、療效確切等優(yōu)點，近年來臨床研究發(fā)現(xiàn)其對腦膠質(zhì)瘤亦具有較好的療效［1］。目前ADM臨床主要用藥方式為靜脈注射，藥效迅速、劑量準確;然而ADM靜脈給藥難以通過血腦屏障，且存在心臟毒性、骨髓抑制等不良反應，造成患者順應性差，因此在一定程度上限制了其用于腦膠質(zhì)瘤的治療［2－3］。鼻腔給藥(intranasal administration，i.n.)可以使藥物通過上鼻甲吸收進入腦脊液，從而進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，有效增加腦內(nèi)藥物濃度，如舒馬曲坦［4］，它是已被FDA批準的用于治療偏頭痛的經(jīng)鼻腔給藥的藥物。納米粒(nanoparticles，NPs)是一種新型靶向膠態(tài)藥物載體，具有低毒、高效、緩釋等優(yōu)點，且能實現(xiàn)藥物的靶向傳遞［5］。Orthmann 等［6］亦指出納米?？捎行мD(zhuǎn)運藥物通過血腦屏障，是腦靶向給藥的理想載體之一。殼聚糖(chitosan，CS)作為一種新型的載體材料，可以控制藥物釋放、延長藥物療效、增強制劑靶向性，且具有安全無毒、生物相容性良好等優(yōu)點，已被廣泛應用于制備各類納米粒。我們實驗室以殼聚糖為載體材料成功制備了ADM納米粒(ADM-CS-NPs)，然而關(guān)于該給藥系統(tǒng)經(jīng)鼻腔給藥是否增加腦內(nèi)ADM的濃度，目前國內(nèi)外尚未見相關(guān)報道。因此本課題研究ADM-CS-NPs鼻腔給藥后的腦內(nèi)藥動學特性，以期考察ADM-CS-NPs經(jīng)鼻腔給藥提高腦內(nèi)ADM濃度的可行性。

1 材料

1.1藥品與試劑鹽酸阿霉素(浙江海正制藥有限公司，純度＞98%，批號090320);鹽酸阿霉素標準品(中國藥品生物制品檢定所，批號110757-200206);人工腦脊液(1.0 mmol·L－1MgCl2，145.0 mmol·L－1NaCl，1.2 mmol·L－1CaCl2，2.7 mmol·L－1KCl，0.45 mmol·L－1NaH2PO4，1.55 mmol·L－1Na2HPO4，pH=7.4);水合氯醛(上海化學試劑采購供應五聯(lián)化工廠，批號20090401);甲醇(色譜純，美國 Honeywell Burdick＆Jackson公司，批號10071753);其他試劑均為分析純。

1.2儀器Agilent1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司);透射電子顯微鏡(日本 Jeol公司);Malvern Measurement粒度測定儀(英國Malvern公司);OptimaMAX Uitrac-elrifuge超速離心機(美國Beckman公司);大鼠鼻黏膜給藥裝置(專利:ZL200520013525.5);微透析腦立體定位架及實驗裝置系統(tǒng)(美國BAS公司);微透析腦探針(美國BAS公司)。

1.3實驗動物清潔級SD大鼠(300±10)g，♂，由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供(合格證號SCXK(滬2007-0005))。所有動物實驗均按照浙江大學動物飼養(yǎng)和使用指南進行。

2 方法

2.1ADM-CS-NPs的制備稱取1 mg ADM和10 mg殼聚糖，溶于10 ml體積分數(shù)為0.1的乙酸溶液中，用0.01 mol·L－1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) pH值至5.0，在恒速磁力攪拌(900 r·min－1)下緩慢滴入1.2 g·L－1的三聚磷酸鈉(sodium tripolyphosphate，TPP)溶液2 ml，繼續(xù)同條件下攪拌30 min，探頭超聲3 min，用0.45 μm的微孔濾膜濾過，得ADM-CSNPs膠體溶液。將制得的膠體溶液低溫超速離心40 min(4℃，40 000 r·min－1)，棄去上清液，沉淀物用蒸餾水洗滌3次后凍干，即得ADM-CS-NPs凍干粉。

2.2ADM-CS-NPs的質(zhì)量評價取適量凍干粉加水稀釋一定倍數(shù)，滴于專用銅網(wǎng)上，用1.5%磷鎢酸染色，自然晾干，用透射電子顯微鏡觀察外觀形態(tài);用粒度測定儀測定ADM-CS-NPs的粒徑;采用超速離心法［7］測定包封率，并測定載藥量。

2.3腦透析液中ADM測定方法的建立

2.3.1色譜條件色譜柱:Platisil ODS(150 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:甲醇 －0.2% 磷酸(50 ∶50);流速:1.0 ml·min－1;柱溫:25℃;檢測波長:233 nm;進樣量:20 μl。

2.3.2專屬性考察分別取空白透析液、空白透析液添加ADM對照品溶液、ADM-CS-NPs大鼠鼻腔給藥后的透析液樣品，按“2.3.1”項下條件考察專屬性。

2.3.3標準曲線制備精密稱取減壓干燥至恒重的ADM對照品2.00 mg，置于10 ml量瓶中，用超純水溶解、定容，作為ADM對照品貯備液。以人工腦脊液將對照品貯備液稀釋成2.0、10.0、20.0、40.0、56.0、72.0、80.0、160 mg·L－1系列濃度的標準溶液，按“2.3.1”項下條件測定，記錄峰面積，以峰面積(A)對藥物質(zhì)量濃度(C)進行線性回歸，繪制標準曲線。

2.3.4精密度及方法回收率測定精密移取低(20.0 mg·L－1)、中(80.0 mg·L－1)、高(160 mg·L－1)3個濃度的標準溶液適量，按“2.3.1”項下條件操作，分別在1日內(nèi)測定5次和連續(xù)測定5日(每日測定1次)，記錄峰面積，考察方法的日內(nèi)和日間精密度。

分別配制低(20.0 mg·L－1)、中(80.0 mg·L－1)、高(160 mg·L－1)3 個濃度的人工腦脊液樣品各3份，按“2.3.1”項下條件操作，記錄峰面積，計算方法回收率。

2.4腦內(nèi)藥動學研究

2.4.1大鼠腦微透析手術(shù)SD大鼠用10%的水合氯醛(300 mg·kg－1)腹腔注射麻醉，其頭部固定于大鼠腦立體定位儀上，暴露顱骨，定位前囟，并以前囟為微透析探針定位的參考點。在前囟后5.2 mm、矢狀線右旁開5.1 mm的骨表面處，用牙科高速鉆機在顱骨上鉆開一能插入微透析探針底座(MD-2251)的小洞。將微透析探針植入腦骨表面下8.0 mm，即右側(cè)海馬，并用牙托粉和顱骨螺釘將底座固定于顱骨上。術(shù)后大鼠單籠生理恢復7 d，溫度(23±1)℃，相對濕度50% ～70%，晝夜12 h人工交替，自由飲食和飲水。

2.4.2微透析探針在體回收率運用反微透析法測定ADM腦微透析探針在體回收率。按“2.4.1”項下方法操作，微透析腦探針(MD-2200)埋植手術(shù)結(jié)束后，以濃度分別為10.0、50.0 和100 μg·L－1的ADM 灌流液灌流，流速為2 μl·min－1，每 30 min 收集1次透析液，共收集8 h。高效液相色譜法測定ADM的濃度，根據(jù)下述公式計算探針在右側(cè)海馬的在體回收率，用于透析部位透析液中實際藥物濃度的校正。

Cdia、Cper和CBIF分別為透析液、灌流液和腦組織間液中的ADM濃度。在反透析過程中，假設(shè)探針周圍腦組織間液中ADM濃度為零(CBIF=0)。

2.4.3給藥方案及樣品采集給藥方案:將24只SD♂大鼠隨機分成4組(每組6只):ADM-Sol鼻腔給藥組［ADM-Sol(i.n.)］、ADM-Sol靜脈注射組［ADM-Sol(i.v.)］、ADM-CS-NPs鼻腔給藥組［ADMCS-NPs(i.n.)］和 ADM-CS-NPs靜脈注射組［ADMCS-NPs(i.v.)］。給藥劑量為 1.45 mg·kg－1ADM。實驗前24 h大鼠禁食但自由飲水。

樣品采集:按“2.4.1”項下方法進行手術(shù)，微透析腦探針(MD-2200)手術(shù)結(jié)束后灌流人工腦脊液，流速為 3 μl·min－1，平衡 30 min 后，流速調(diào)為 2 μl·min－1。采用大鼠鼻黏膜給藥裝置給藥，同時使用自動恒溫冷凍收集器收集透析液，每10 min收集1次，連續(xù)收集1 h，再每1 h收集1次透析液，連續(xù)自動收集24 h。收集結(jié)束后大鼠腹腔注射過量戊巴比妥鈉麻醉后，用4%多聚甲醛溶液心臟灌注固定。取大鼠大腦4 μm冠狀切片，顯微鏡下觀察右側(cè)海馬部位。植入部位不正確數(shù)據(jù)不予使用。透析液樣品按“2.3.1”項下條件測定，通過ADM在體回收率校正，得到各時間點的ADM實際濃度，繪制ADM海馬部位的藥物濃度－時間曲線。

2.4.4數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理:Tmax和Cmax以實測值計，梯形法計算 AUC0→11h，統(tǒng)計矩法計算 MRT。用SPSS17.0軟件進行方差分析，比較 ADM-Sol(i.n.)組、ADM-Sol(i.v.)組、ADM-CS-NPs(i.n.)組、ADM-CS-NPs(i.v.)組間Cmax、AUC0→11h、MRT 的差異。

3 結(jié)果

3.1ADM-CS-NPs的質(zhì)量評價透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)ADM-CS-NPs呈圓形或類圓形，表面圓滑，大小及分布較均勻，粒子之間未見粘連和聚集現(xiàn)象(Fig 1)。測得ADM-CS-NPs平均粒徑為(98.80±0.70)nm，PDI為(0.084±0.001)。測得包封率和載藥量分別為(78.37±1.52)%和(4.46±0.16)%。

Fig 1 Transmission electron micrograph of ADM-CS-NPs(×80 000)

3.2透析液中ADM方法學考察透析液中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾樣品的色譜分析，方法專屬性強。腦脊液中ADM含量測定的標準曲線方程為:A=5.569 8 C+17.085，r=0.997 2(n=6)，線性范圍2.0 mg·L－1～160 mg·L－1。低、中、高濃度的標準溶液的日內(nèi)RSD分別為2.57%、1.72%、1.42%(n=5);日間 RSD分別為3.12%、2.37%、2.21%(n=5);低、中、高濃度的樣品的方法回收率分別為93.61%、98.08%、101.34%，RSD分別為 2.98%、2.15%、1.80%(n=3)。說明方法精密度與準確度良好。

3.3腦內(nèi)藥動學結(jié)果

3.3.1ADM微透析腦探針在體回收率測定ADM微透析腦探針在大鼠海馬部位的在體平均回收率為(13.54±0.35)%。

3.3.2藥物濃度－時間曲線大鼠給予ADM-Sol(i.n.)、ADM-Sol(i.v.)、ADM-CS-NPs(i.n.)、ADM-CS-NPs(i.v.)后腦脊液中的平均藥物濃度－時間曲線見Fig 2。

Fig 2 Profiles of mean concentration-time of ADM-CS-NPs or ADM-Sol via i.n.or i.v.administration in hippocampus of rats(±s，n=6)

3.3.3藥動學參數(shù)大鼠給予 ADM-Sol(i.n.)、ADM-Sol(i.v.)、ADM-CS-NPs(i.n.)、ADM-CSNPs(i.v.)后主要藥動學參數(shù)見 Tab 1，主要藥動學參數(shù)柱狀圖見Fig 3。

4 討論

納米粒的制備方法有多種。Cetin等［8］采用離子交聯(lián)法制備了bFGF殼聚糖納米粒，所得納米粒外觀形態(tài)、載藥量、包封率、粒徑分布等指標均良好。本實驗采用離子交聯(lián)法制得的ADM-CS-NPs表面光滑圓整，平均粒徑(98.80±0.70)nm、PDI(0.084±0.001)、包封率(78.37±1.52)%、載藥量(4.46±0.16)%，各項指標均符合納米粒鼻腔給藥的要求，說明采用離子交聯(lián)法制備鼻腔用ADM-CS-NPs切實可行。

大腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的腫瘤，其病變范圍較廣泛，病變部位可以是海馬、額葉、顳葉、枕葉、頂葉、基底節(jié)等，而腦微透析探針埋植于海馬區(qū)是一種通用、可靠的方法，故本實驗采用腦微透析在海馬部位取樣技術(shù)［9］。

Tab 1 Brain pharmacokinetic parameters of ADM-CS-NPs or ADM-Sol via i.n.or i.v.administration(±s，n=6)

Tab 1 Brain pharmacokinetic parameters of ADM-CS-NPs or ADM-Sol via i.n.or i.v.administration(±s，n=6)

Parameters ADM-CS-NPs(i.n.)ADM-Sol(i.n.)ADM-CS-NPs(i.v.)ADM-Sol(i.v.)Tmax/min 300.00 ±26.12 20.00 ±2.91 180.00 ±19.11 20.00±2.00 Cmax/mg·L －1 93.00 ±8.53 90.00 ±7.31 19.11 ±1.91 10.70 ±0.96 AUC0→11h/mg·h·L －1 17809.05 ±650.24 4736.70 ±53.40 5159.97 ±120.59 312.68 ±4.99 MRT/min 390.49 ±6.87 73.43 ±2.37 281.53 ±4.9923.39 ±1.32

Fig 3Histogram of brain pharmacokinetic parameters of ADM-CS-NPs or ADM-Sol via i.n.or i.v.administration(±s，n=6)

由 Fig 2 及 Tab 1 可知，ADM-CS-NPs(i.n.)與ADM-CS-NPs(i.v.)、ADM-Sol(i.v.)、ADM-Sol(i.n.)相比，ADM-CS-NPs(i.n.)的Cmax值最高，AUC0→11h值最大，說明 ADM-CS-NPs(i.n.)吸收入腦的藥物量最多;Tmax值最大，表明ADM-CS-NPs(i.n.)起效最慢，具有緩釋作用;而MRT值最大，提示ADM-CS-NPs(i.n.)在腦內(nèi)消除緩慢。

Fig 3(A)、(B)結(jié)果顯示，與靜脈給藥相比，鼻腔給藥可提高腦內(nèi)ADM藥物濃度，有效實現(xiàn)腦內(nèi)遞藥。ADM-Sol通過i.v.給藥，血液分布容積較大，暴露于血腦屏障的藥物量少，并且血腦屏障為靜注藥物入腦主要障礙［10］，故藥物吸收入腦緩慢且腦內(nèi)遞藥量減少;ADM-Sol通過i.n.給藥，接觸到有效吸收部位(鼻黏膜)的藥物量多，且鼻腔具有獨特的生理結(jié)構(gòu)，可通過嗅神經(jīng)通路和嗅黏膜上皮通路使藥物直接繞過血腦屏障直接進入顱內(nèi)，即鼻－腦通路發(fā)揮中樞治療作用，故經(jīng)鼻腔給藥后腦內(nèi)ADM濃度明顯高于靜脈給藥。ADM-CS-NPs通過鼻腔給藥的腦內(nèi)遞藥量明顯高于靜脈注射給藥，其原因一方面可能是由于殼聚糖表面荷正電，可通過靜電作用與荷負電的鼻黏膜上皮組織結(jié)合，從而延長藥物在鼻黏膜組織的滯留時間，促進藥物在鼻腔的吸收。另一方面，載藥納米粒可能通過表面活性劑效應，緊密連接開放，胞吞作用，跨膜直接入腦，抑制外排泵作用等機制穿透血腦屏障［11－12］，從而提高ADM腦內(nèi)濃度。Yue等［13］研究亦發(fā)現(xiàn)，經(jīng)鼻腔給藥后，腦內(nèi)的石杉堿甲AUC明顯高于經(jīng)靜脈給藥。

Fig 3(C)、(D)結(jié)果顯示，ADM制成納米粒，可延長ADM在腦內(nèi)有效濃度的持續(xù)時間，具有緩釋、長效作用。原因可能有:ADM通過化學或物理作用分散于納米粒內(nèi)部或吸附于納米粒表面，其中吸附于表面的藥物釋放較快，而分散于載體材料CS中的藥物則需通過CS的小孔或隨著CS的降解緩慢釋放。Lee等［14］亦提出氧氟沙星制備成白蛋白微粒/納米粒后，腦內(nèi)釋放超過48 h，具明顯的緩釋作用。

本實驗以CS為載體材料，制備ADM-CS-NPs，成功建立大鼠腦微透析海馬部位取樣技術(shù)，研究了納米粒和溶液劑兩種劑型經(jīng)不同給藥途徑對ADM腦內(nèi)藥動學的影響。結(jié)果顯示ADM-CS-NPs鼻腔給藥可以實現(xiàn)ADM腦內(nèi)遞藥，并延長腦內(nèi)有效藥物濃度的持續(xù)時間，發(fā)揮長效作用。

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