四丁基丙二胺對(duì)人MG63骨髓瘤細(xì)胞增殖、凋亡和遷移能力的影響

張賀吉，王 凱，韓 鈺，楊建林，王艷林

(1.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，三峽大學(xué)分子生物學(xué)研究所，湖北宜昌 443002;2.武漢工程大學(xué)，湖北省新型反應(yīng)器與綠色化學(xué)工藝重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430073)

多胺(腐胺、精瞇、精胺)是存在于真核細(xì)胞中的有機(jī)小分子，廣泛參與細(xì)胞增殖、分化和基因表達(dá)與調(diào)控等重要生理功能［1－3］。近來研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞的快速生長依賴于細(xì)胞內(nèi)異常升高的多胺含量，由此多胺代謝途徑成為抗腫瘤治療和抗腫瘤藥物設(shè)計(jì)的新靶點(diǎn)［4－5］。多胺類似物是與天然多胺具有相似結(jié)構(gòu)的小分子化合物，它們或者通過干擾多胺代謝而耗竭細(xì)胞內(nèi)多胺庫，或者競(jìng)爭(zhēng)性抑制多胺的正常功能而阻遏腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［6－9］。正在研究中的一批多胺類似物在體外雖能有效抑制腫瘤細(xì)胞生長，但高效低毒、能用于人體腫瘤治療的類似物卻為數(shù)不多。研發(fā)和篩選新的多胺類似物用于臨床抗腫瘤治療仍為當(dāng)前的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域。四丁基丙二胺(tetrabutyl propanediamine，TBP)是本課題組協(xié)作單位武漢工程大學(xué)新合成的一種腐胺類似物，具有潛在的抗腫瘤藥理活性。本研究分析了TBP對(duì)人MG63骨髓瘤細(xì)胞生長，凋亡及遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1材料人骨髓瘤細(xì)胞株MG63由本實(shí)驗(yàn)室保存，多胺類似物四丁基丙二胺(tetrabutyl propanediamine，TBP)由武漢工程大學(xué)王凱副教授合成，PVDF膜為Millipore公司產(chǎn)品;ECL試劑盒為Thermo公司產(chǎn)品;兔抗人Bax和細(xì)胞色素C多克隆抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品，羊抗兔IgG-HRP為Jackson公司產(chǎn)品。其它化學(xué)試劑來自Invitrogen和Sigma公司。Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板為Corning公司產(chǎn)品。GelLogic-200凝膠圖像分析儀為Kodak公司產(chǎn)品，EPLCS XL流式細(xì)胞分析儀為Becman-Coulter公司產(chǎn)品，全波長酶標(biāo)儀為Thermo公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖速度取對(duì)數(shù)生長期的MG63細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×107·L－1后接種于96孔板中，每孔100 μl。37℃培養(yǎng)24 h后，向孔內(nèi)加入含不同濃度TBP的DMEM培養(yǎng)液100 μl并繼續(xù)培養(yǎng)。在設(shè)定的培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)去培養(yǎng)液，加入含200 mg·L－1MTT的無血清培養(yǎng)液，37℃孵育4 h后去上清，然后加入 DMSO 200 μl·well－1，室溫振搖20 min溶解結(jié)晶，570 nm波長下檢測(cè)每孔的吸光值A(chǔ)。細(xì)胞生存率/%=A藥物/A對(duì)照×100%。

1.2.2Western blot法鑒定相關(guān)基因在蛋白水平上的表達(dá)將收集的培養(yǎng)細(xì)胞分為兩份，一份用細(xì)胞裂解液 A(10 mmol·L－1HEPES，pH 7.2，210 mmol·L－1D-mannitol，70 mmol·L－1sucrose，5 mmol·L－1sodium succinate，0.2 mmol·L－1EGTA，100 mg·L－1digitonin)在冰浴裂解20 min，室溫保溫5 min后，600 r·min－1離心 5 min去細(xì)胞核，將上清轉(zhuǎn)移至另一試管中，12 000 r·min－1離心10 min去線粒體，取上層裂解液用于細(xì)胞色素C(Cyt-C)檢測(cè)。另一份用細(xì)胞裂解液 B(20 mmol·L－1Tris-HCl，pH 8.0，150 mmol·L－1NaCl，2 g·L－1NP-40)裂解、離心取上清用于Bax的檢測(cè)。上述裂解液中的蛋白經(jīng)10%的SDS-PAGE分離后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。膜先后與第一抗體和HRP標(biāo)記的第二抗體作用，ECL法示蹤目標(biāo)蛋白。實(shí)驗(yàn)中以β-actin作為內(nèi)參照蛋白。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)細(xì)胞周期收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，用含75%乙醇和0.5 mmol·L－1EDTA的PBS重懸細(xì)胞，4℃固定30 min后2 000 r·min－1離心 5 min 棄上清，用含1 g·L－1Triton X-100和50 mg·L－1RNAse的 PBS混合液500 μl重懸細(xì)胞，加入 0.5 g·L－1PI(Propidium Iodide)90 μl，37℃避光保溫30 min，尼龍膜過濾，流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)。

1.2.4Transwell技術(shù)分析腫瘤細(xì)胞的遷移能力無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)MG63細(xì)胞4 h，收集細(xì)胞后用含2 g·L－1BSA的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為 2.5 ×108·L－1，取 200 μl細(xì)胞懸液鋪在Transwell上室中，同時(shí)加入TBP(終濃度為 40 μmol·L－1)，下室內(nèi)加入 800 μl含 10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18 h后，PBS清洗小室細(xì)胞2次，4%多聚甲醛室溫固定小室膜30 min，PBS清洗3次后，蘇木精染細(xì)胞核5 min，清水浸泡20 min，用棉簽輕輕擦拭上室內(nèi)側(cè)面的細(xì)胞，同時(shí)清水沖洗3～5遍，用鑷子撥下小室的膜，下側(cè)面向上平鋪于載玻片，顯微鏡下隨機(jī)觀察5個(gè)視野并做細(xì)胞計(jì)數(shù)，取其平均值代表細(xì)胞的遷移能力。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用組間t檢驗(yàn)經(jīng)SPSS 2.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用±s表示。

2 結(jié)果

2.1TBP對(duì)MG63細(xì)胞增殖的影響用MTT法檢測(cè)了TBP對(duì)MG63細(xì)胞生長的影響，結(jié)果顯示，TBP能明顯抑制MG63細(xì)胞生長，抑制效應(yīng)呈濃度和時(shí)間依賴性(Tab 1)。

2.2TBP對(duì)腫瘤細(xì)胞生長周期的影響分別收集40 μmol·L－1TBP 處理48 h 和對(duì)照 MG63 細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化，結(jié)果顯示，TBP處理MG63細(xì)胞后，G1期和G2期細(xì)胞增加但S期細(xì)胞明顯減少，同時(shí)出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞(亞凋亡峰)，提示多胺類似物TBP可能通過干擾細(xì)胞周期而影響MG63細(xì)胞的正常生長，并同時(shí)誘導(dǎo)MG63骨肉瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡(Tab 2，F(xiàn)ig 1)。

Fig 1 Effect of TBP on cell cycle and apoptosis in MG63 cells

Tab 1 Effect of TBP on cell survival rate in MG63 cells with MTT method(±s，n=3)

Tab 1 Effect of TBP on cell survival rate in MG63 cells with MTT method(±s，n=3)

The cells were treated by 0～40 μmol·L－1TBP for 24～72 h.＊＊P ＜0.01 vs 0 μmol·L －1TBP group.

TBP/μmol·L －124 h 48 h 72 h 0 100 ±1.50 100 ±1.59 100 ±1.12 10 107.77 ±2.10 105.47 ±1.60 87.38 ±0.69＊＊20 90.08 ±1.53＊＊ 93.54 ±1.26＊＊65.63 ±2.85＊＊40 74.58 ±2.10＊＊ 50.33 ±1.14＊＊21.86 ±4.50＊＊80 59.44 ±1.88＊＊ 35.75 ±1.93＊＊15.58 ±1.29＊＊

Tab 2 Effect of TBP on cell cycle in MG56 cells with flow cytometry method(±s，n=3)

Tab 2 Effect of TBP on cell cycle in MG56 cells with flow cytometry method(±s，n=3)

The cells were treated by 40 μmol·L －1TBP for 48 h.＊＊P ＜0.01 vs control group

MG63-control 75.61 ±0.55 12.57±0.40 11.82±0.45 0.46 ±0.06 MG63-TBP 79.68 ±1.42＊＊16.24±0.43＊＊ 4.08±0.79＊＊11.74 ±1.44＊＊

2.3TBP對(duì)DNA片段化的影響40 μmol·L－1TBP處理MG63細(xì)胞48 h后，分別提取處理細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞胞質(zhì)中的DNA，然后對(duì)樣本進(jìn)行Agarose凝膠電泳分析，結(jié)果顯示，TBP處理導(dǎo)致凋亡細(xì)胞典型的DNA的片段化現(xiàn)象(Fig 2)。

Fig 2 Cell apoptosis induced by TBP with DNA degradation assay

2.4TBP對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的影響用Western blot分析了TPB處理后，MG63細(xì)胞質(zhì)中凋亡相關(guān)蛋白Bax和Cyt C水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TBP導(dǎo)致促凋亡蛋白Bax蛋白水平增加和Cyt C從線粒體的釋放(Fig 3)。

2.5藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移能力的影響用Transwell技術(shù)分析了TBP對(duì)MG63細(xì)胞遷移能力的影響，結(jié)果顯示，TBP處理細(xì)胞降低MG63細(xì)胞的遷移能力，與對(duì)照細(xì)胞比較，差異具有顯著性(Tab 3)。

Fig 3 Bax and Cyt C levels in the cytosol of MG63 cells with Western blot

Tab 3 Effect of TBP on cell migration in MG63 cells(cell number/Each field of vision，±s，n=5)

Tab 3 Effect of TBP on cell migration in MG63 cells(cell number/Each field of vision，±s，n=5)

The cells were treated by 40 μmol·L －1TBP for 48 h.＊＊P ＜0.01 vs control group

Group Migrated cell MG63-control 43.7 ±9.29 MG63-TBP 5.2 ±1.58＊＊

3 討論

通過控制多胺代謝和干擾多胺功能而抑制腫瘤生長是抗腫瘤藥物設(shè)計(jì)的新策略，其中抗腫瘤多胺類似物的合成與篩選為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，本研究應(yīng)用的TBP即為新合成的一種腐胺對(duì)稱性修飾物。為探討TBP作為抗腫瘤藥物的潛在價(jià)值，本研究以人骨髓瘤MG63細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分析了TBP對(duì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響。結(jié)果證實(shí)，TBP能有效抑制MG63細(xì)胞的生長，且這種抑制呈時(shí)間和劑量依賴性。隨后的細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡分析提示，上述抑制作用可能與TBP抑制細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。多胺能與DNA分子結(jié)合，參與DNA構(gòu)象轉(zhuǎn)換，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、染色質(zhì)凝縮和解凝縮等過程，以及調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子與DNA元件間的相互作用，并由此加快DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂［10－12］。作為一種多胺的結(jié)構(gòu)類似物，TBP可能干擾了上述多胺的正常功能，導(dǎo)致DNA復(fù)制障礙，細(xì)胞周期抑制，S期細(xì)胞明顯減少。腫瘤細(xì)胞的典型特征之一是喪失發(fā)生凋亡的能力，因而誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡是抗腫瘤藥物設(shè)計(jì)的重要目標(biāo)。細(xì)胞凋亡分為外源性凋亡和內(nèi)源性凋亡兩大類，而線粒體結(jié)構(gòu)和功能的改變是內(nèi)源性細(xì)胞凋亡的核心事件［13］。在本研究中，TBP處理導(dǎo)致MG63細(xì)胞發(fā)生典型的DNA片段化現(xiàn)象和流式細(xì)胞分析中亞凋亡峰(Sub-G1)的出現(xiàn)，以及線粒體促凋亡蛋白Bax和Cyt C在胞質(zhì)中含量增加，均提示TBP激活了線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑。

上述結(jié)果提示，TBP有作為骨髓瘤治療藥物的臨床應(yīng)用前景。在后續(xù)研究中，我們將進(jìn)一步探討TBP抗腫瘤藥理活性的分子機(jī)制，特別是對(duì)多胺代謝的影響，以及在動(dòng)物水平上評(píng)價(jià)該藥的安全性。

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