HPLC法測定帕那珠利含量

王翔林，王冠楠，錢 琛，陳 晨，康玉柱

(1.沈陽藥科大學藥學院，沈陽 110016;2.遼寧省獸藥飼料畜產品質量安全檢測中心，沈陽 110016;3.沈陽順旺動物藥業(yè)有限公司，沈陽 110300)

帕那珠利(Ponazuril)是德國Bayer公司開發(fā)的一種三嗪酮類抗原蟲和球蟲引起疾病的藥物，化學名為(1－甲基－3－［3－甲基－4－(4－三氟甲基砜基 －l－苯氧基)－苯基］－［1，3，5］－三嗪 －2，4，6－三酮，結構式見圖1。2001年經FDA批準在美國上市后迅速占領美國市場，成為美國獸醫(yī)常用的抗原蟲藥物之一。目前，帕那珠利在中國尚未上市，但其強大的抗原蟲效果和相對低廉的價格，決定了其在不遠的將來會被廣泛使用。

帕那珠利的含量測定方法主要有兩類:HPLC法和LC－MS法，本文研究的是HPLC法。該方法相比較而言有速度快、成本低、簡便易行的特點，且原料藥含量較高，沒必要使用液質連用檢測。

帕那珠利雖然早在2001年就在FDA批準上市，但至今英國藥典(BP)和美國藥典(USP)上均不能找到該藥物的原料藥檢測方法。帕那珠利的最大吸收峰為250 nm(圖2)，本實驗的測定方法是在參考文獻的基礎上，經過多次實驗確定的。經測試，該色譜條件可以進行方法學驗證。

1 儀器與材料

高效液相色譜儀:WATERS公司2695型高效液相色譜分析儀;WATERS公司2487型紫外檢測器;Diamonsil C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm，美國迪馬公司);工作站:WINDOWS系統(tǒng)下的Empower軟件;KQ5200B超聲波清洗器(江蘇昆山超聲波儀器廠)。AG285型電子天平(METTLER TOLEDO公司，精度為十萬分之一);紫外分光光度計(SHIMADZU公司UV－1601型)。

帕那珠利對照品:批號 H20110508，純度99.5%，沈陽順旺動物藥業(yè)有限公司提供;帕那珠利樣品:批號20110618，沈陽順旺動物藥業(yè)有限公司提供;乙腈為色譜純，Tedia公司;乙酸為優(yōu)級純，北京化工廠;水為蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱:Diamonsil C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:0.2%乙酸水溶液－乙腈(43∶57);流速1 mL/min;檢測波長255 nm;柱溫35℃。

2.2 樣品和對照品儲備液的制備 精密稱定帕那珠利樣品0.02554 g和對照品0.02668 g，分別置于100 mL容量瓶中，加入少量流動相，超聲溶解后用流動相稀釋至刻度，分別作為樣品儲備液和對照品儲備液。

2.3 系統(tǒng)適應性實驗 精密量取對照品儲備液1 mL，置于10 mL容量瓶中，加入流動相稀釋到刻度，搖勻。過 0.45 μm 濾膜后進樣 10 μL，結果見圖3。主峰帕那珠利理論塔板數(shù)為17236，分離度為 12.97，拖尾因子為 0.99。

圖3 系統(tǒng)適用性圖譜

2.4 方法學研究

2.4.1 線性 分別精密量取對照品儲備液0.4、1、2、3、4 mL，置于 10 mL 容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，過 0.45 μm 濾膜，分別進樣 10 μL，記錄色譜圖。以峰面積(y)對進樣濃度(x)繪制標準曲線見圖4，得到回歸方程 y=25623x+2253.7，R2=0.9999。

圖4 標準曲線

2.4.2 精密度

2.4.2.1 儀器精密度 精密量取對照品儲備液1 mL，置于10 mL容量瓶中，加入流動相稀釋至刻度，搖勻。過 0.45 μm 濾膜后進樣 10 μL，重復進樣 5 次，色譜峰面積為 645250、648470、648432、649585、647820，RSD 為 0.25% 。

2.4.2.2 方法重復性 精密稱定帕那珠利樣品和對照品，分別置于100 mL容量瓶中，加入少量流動相，超聲溶解后用流動相稀釋至刻度。然后精密量取樣品和對照品溶液各1 mL，分別加入到10 mL容量瓶中。用流動相稀釋至刻度。搖勻后過0.45 μm濾膜，進樣10 μL(每個樣進樣兩次)，計算樣品的百分含量。結果見表1，平均含量為99.2%，RSD為0.69%(n=5)。

表1 方法重復性試驗數(shù)據(jù)

2.4.3 回收率 精密量取9份樣品儲備液各2.5 mL，分別置于9個25 mL容量瓶中，然后精密量取對照品儲備液2.0、2.5、3.0 mL 各 3 份，分別加入上述9個容量瓶中作為低、中、高濃度組。將9個容量瓶分別用流動相稀釋至刻度，搖勻后過0.45 μm濾膜，進樣10 μL(每個樣品進樣兩次)，平均后的峰面積見表2，平均回收率為98.6%，RSD為1.2%(n=9)。

2.4.4 穩(wěn)定性 精密量取帕那珠利樣品0.02613 g和對照品0.02486 g，分別置于100 mL容量瓶中，加入少量流動相，超聲溶解后用流動相稀釋至刻度。精密量取樣品和對照品溶液各5 mL，分別加入兩個50 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度。搖勻后過0.45 μm 濾膜，在0、3、6、9、12、15、18、21、24 h進樣10 μL(每個樣品進樣兩次平均)，計算樣品的百分含量，結果見表3，含量平均為97.2%，RSD為 0.74%。

3 討論與結論

3.1 本實驗參考了文獻報道的多種流動相條件，并通過大量實驗考察了磷酸鹽緩沖液－乙腈系統(tǒng)、0.5%乙酸銨水溶液－乙腈系統(tǒng)、水－乙腈系統(tǒng)、0.05 mol/L甲酸水溶液 －乙腈系統(tǒng)、0.1%乙酸水溶液－甲醇系統(tǒng)、水－甲醇系統(tǒng)和0.2%乙酸水溶液－乙腈系統(tǒng)等流動相條件，最終確定以0.2%乙酸水溶液－乙腈(43∶57)為流動相較好。

表2 回收率試驗數(shù)據(jù)

表3 穩(wěn)定性試驗數(shù)據(jù)

3.2 帕那珠利的實測最大吸收波長為250 nm，文獻記載的檢測波長為255 nm。分別用250 nm和255 nm進行了實驗，其吸收度和峰面積均符合實驗要求，且帕那珠利的前體原料托曲珠利的最大吸收為255 nm，采用255 nm檢測有利于帕那珠利和其雜質的檢測，因而最終決定采用255 nm為檢測波長。

3.3 本實驗條件理論塔板數(shù)很高，被測組分與雜質的分離度較好，拖尾因子在0.95～1.05之間。說明實驗的色譜條件非常適合進行含量測定。

［1］Dirikolu L，Yohn R，Garrett E F，et al.Quantifications and pharmacokinetics of toltrazuril sulfone(ponazunil)in cattle［J］.Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics，2009，32(3):280－288.

［2］Dirikolu L，Karpiesiuk W，Lehner A F，et al.Synthesis and detection of toltrazuril sulfone and its pharmacokinetics in horses following administration in dimethylsulfoxide［J］.Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics，2009，32(4):368－378.

［3］Hui L，James K P，Sherri B T，et al.A multi－ class method by liquid chromatography－quadrupole ion trap mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography，2006，836(1/2):22 －38.

［4］Mulder P P J，Balzer－ Rutgers P，Brinke E M，et al.Deposition and depletion of the coccidiostats toltrazuril and halofuginone in eggs［J］.Analytica Chimica Acta，2005，529(1/2):331 －337.

［5］Victor H，Magne Y，Oyvin O.Determination of flunixin and tiamulin hydrogen fumarate in meat and toltrazuril and the metabolite toltrazurilsulfon in meat and eggs using LC/MS［J］.Journal of Liquid Chromatography ＆ Related Technologies，2003，26(5):791－801.

［6］Anna M V，Encarnacion M，Martins Claudia P B，et al.Fast liquid chromatography/tandem massspectrometry (highly selective selected reaction monitoring)for the determination of toltrazuril and its metabolites in food［J］.Analytical and Bioanalytical Chemistry，2010，397(7):2893 －2901.

［7］Myoung－Seok K，Jong－ Hwan L，Youn － Hwan H，et al.Plasma disposition of toltrazuril and its metabolites，toltrazuril sulfoxide and toltrazuril sulfone，in rabbits after oral administration［J］.Veterinary Parasitology，2010，169(1/2):51 －56.

［8］Yingjie X，Hangru H，Yonggang G，et al.Determination of toltrazuril and metabolite in chicken plasma by LC/MS［J］.Nanjing Nongye Daxue Xuebao，2006，29(1):127－130.