美國松材線蟲體表攜帶優(yōu)勢細菌的鑒定及致病性

曾腓力，賁愛玲，鄭敬榮，韓正敏

（1.南京林業(yè)大學 森林資源與環(huán)境學院，江蘇 南京 210037；2.浙江省淳安縣林業(yè)局，浙江 淳安 311700；3.南京曉莊學院 生物化工與環(huán)境工程學院，江蘇 南京 211171）

松樹萎蔫病是林木最重要病害之一，能造成松樹大量死亡。雖然人們對該病害有較深入的研究，但對該病害的致病機制至今尚不十分清楚。近年來，松材線蟲Bursaphelenchus xylophilus體表所攜帶細菌的致病性越來越引起人們的關注[1-4]。趙博光等[5-6]發(fā)現，只有細菌和松材線蟲同時存在的松樹才會發(fā)病，并提出了松樹萎蔫病是由線蟲和細菌復合侵染的假說。該假說認為松樹萎蔫病是松材線蟲與其攜帶的致病細菌共同侵入寄主，在松材線蟲提供保護和營養(yǎng)的條件下，由致病細菌分泌毒素導致寄主萎蔫和死亡。還有很多學者相繼證明了感病松樹體內毒素的產生與松材線蟲體表攜帶的細菌有關[1-3，7-12]，賁愛玲[13]提出不同來源的松材線蟲的致病力有強弱之分，而導致致病力變化的原因可能是松材線蟲攜帶細菌的種類不同。美國被認為是松萎蔫病的發(fā)源地，雖然36個州都有病害的分布，但很少見到成片松樹枯死，各地危害并不嚴重。這說明美國松材線蟲體表細菌已經演替到了較高級階段，即美國松材線蟲經過長期進化，其體表攜帶的細菌不斷演替，演替的結果是這些細菌具有繁殖能力強和致病力低等特點。根據這一思路，我們實驗室提出利用美國松材線蟲攜帶的弱致病力細菌，來替代中國松材線蟲體表的細菌，從而降低中國松材線蟲致病力，達到生物防治的目的。為了解美國松材線蟲攜帶細菌的生防能力，本研究從收集的美國松材線蟲蟲株體表分離了優(yōu)勢細菌，用細菌產生的毒素粗提液，對黑松Pinus thunbergii切根苗進行生物毒性測定，并用各細菌菌株與無菌松材線蟲混合接種松苗，比較各株細菌對松苗致病力的強弱，從中篩選到產毒能力低、對松苗致病性弱的細菌菌株。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試木塊為美國進口的2個批次的木材包裝箱，分別由江蘇省出入境檢驗檢疫局安榆林和粟寒提供。供試無菌松材線蟲為浙江松材線蟲蟲株，參照賁愛玲[14]方法制備獲得。

中國松材線蟲攜帶優(yōu)勢細菌菌株分別標記為YG1，YG2，YG3和YG4，分別分離自江蘇、浙江、安徽和福建松材線蟲蟲株體表，由南京林業(yè)大學病理實驗室保存。4株菌株均為熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescence，經測定致病性和毒性均很強[4-5，8，13]。菌株鑒定時使用的2個參比菌株為金黃色葡萄球菌Staphyloccocus aureus和大腸埃希菌Escherichia coli，均由南京林業(yè)大學物理實驗室分離和保存。

1.2 線蟲和細菌分離

采用貝爾曼漏斗法分離木塊中的線蟲。采用稀釋分離法分離線蟲體表的細菌。即在無菌操作下，挑取3～5條線蟲于滅過菌的研缽里，加1 mL滅菌水和少量石英砂充分研磨后，加9 mL無菌水稀釋。取200 μL稀釋液在金氏培養(yǎng)基上涂平板，28℃下恒溫培養(yǎng)48 h。在解剖鏡下根據細菌菌落在培養(yǎng)基上的菌落大小、外觀形態(tài)特征和是否產生熒光等特性，對各細菌菌落進行識別并分離純化和編號，統(tǒng)計每種細菌菌落個數和出現概率。各菌株在平板上連續(xù)劃線純化后，挑細菌單菌落接種到牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)1～2 d后置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細菌無細胞培養(yǎng)液制備

細菌接入牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，28℃，135 r·min-1恒溫搖床振蕩培養(yǎng)48 h。將細菌培養(yǎng)液裝入10 mL離心管內，4℃，12000 r·min-1離心10 min，取上清液用0.22 μm微孔濾膜的細菌過濾器過濾，得到細菌濾液。用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基檢驗是否帶菌，如帶菌，重復上述操作，至濾液中不含菌體后置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 無菌組培苗的培養(yǎng)

參照洪英娣方法[4]，選取飽滿黑松種子，60℃溫水浸泡24 h，充分吸漲后去除不飽滿種子，用1 g·L-1高錳酸鉀處理30 min，流水沖洗2 h。剝去外種皮，無菌條件下用體積分數為70%乙醇浸泡30 s，再用體積分數為0.1%升汞處理3 min，然后用滅菌水沖洗3遍，挑于Murashige-Skoog（MS）基本培養(yǎng)基（瓊脂取1/2量）上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱，暗培養(yǎng)催芽，最后把無菌發(fā)芽的種子移植到MS基本培養(yǎng)基上，25℃，16 h·d-1光照條件下培養(yǎng)1～2個月備用。

1.5 細菌與無菌線蟲懸浮液的制備

將上述分離的細菌單菌落分別接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基里，28℃，135 r·min-1恒溫搖床上震蕩培養(yǎng)36 h，用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基稀釋菌液，調至濃度為1×108菌落形式單位（cfu）·mL-1的細菌懸浮液。

用滅菌水洗下預先培養(yǎng)好的無菌線蟲，調整為10000條·mL-1線蟲懸浮液，并用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基檢驗線蟲研磨液是否帶菌。將線蟲懸浮液分別用滅過菌的5 mL離心管分裝，每管3 mL，每個離心管中加入50 μL制備好的細菌懸浮液，混合處理1 h，中間不斷翻倒，使線蟲與細菌充分結合后，4℃，1500 r·min－1離心5 min，除去上清液，用滅菌水定容到3 mL制成懸浮液，備用。

1.6 細菌無細胞培養(yǎng)液毒力測定

在大廣口瓶內放入3個小青霉素瓶，周圍加少量水保濕，封口膜封口滅菌。在無菌條件下往每個小青霉素瓶內加入3 mL細菌無細胞培養(yǎng)液，以滅菌水和牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基為對照。然后插入無菌黑松切根苗，每個小青霉素瓶1株無菌苗，封口膜封瓶口，平放于光照培養(yǎng)箱內，25℃，16 h·d－1光照條件下培養(yǎng)，觀察記錄萎蔫情況和萎蔫時間。

1.7 細菌與無菌線蟲混合懸浮液對松苗致病性測定

在廣口瓶內放3個小青霉素瓶，每個小青霉素瓶加3 mL水，封口膜封口滅菌。在無菌條件下往每個小青霉素瓶插1株切根組培苗，然后用無菌細針在無菌苗頂芽下2片葉子處刺個傷口，并在傷口處附上一團無菌的脫脂小棉球（能吸附200～300 μL懸浮液），再往脫脂棉球上滴200 μL細菌與線蟲混合懸浮液，并保證小棉球在24 h內保持濕潤，設重復3個·處理-1，以單獨接種無菌線蟲、野生線蟲（中國浙江松材線蟲）、滅菌水為對照，接種后將廣口瓶封口，培養(yǎng)箱內25℃，16 h·d－1光照條件下培養(yǎng)，觀察記錄萎蔫情況，參照徐福元等[15]病害分級方法進行分級。

1.8 細菌菌株鑒定

參照《伯杰細菌鑒定手冊·第9版》[16]，觀察各菌株在營養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征和一般生化檢驗。

采用細菌16S rDNA序列分析法進行細菌鑒定：向裝液量為30 mL營養(yǎng)肉湯（NB）培養(yǎng)基的150 mL三角瓶中接種供試菌株，恒溫振蕩器（120 r·min－1，30℃）振蕩培養(yǎng)20 h后供菌體DNA提取。菌體DNA的提取分離、純化使用Fast DNA·試劑盒。以細菌的基因組DNA為模板，用細菌16S rRNA基因的通用引物進行 PCR 擴增[17-18]。

通用引物序列如下：引物 1，8f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；引物 2，1541r：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′（上海生工生物工程技術服務有限公司合成）。

16 S rRNA 基因的擴增反應體系包括模板 DNA 1.5 μL，上下游引物 50 μmol各 0.5 μL，2.5 mmol·L－1三磷酸堿基脫氧核苷酸（dNTPs） 4 μL，5 × 16.67 nkat·μL－1Taq DNA 酶 0.5 μL，10 × 緩沖液 5 μL，15 mmol·L－1鎂離子 3 μL，重蒸水加至 50 μL。

擴增反應條件為：94℃變性5 min后開始以下循環(huán)，94℃變性反應1 min，55℃退火反應1 min，72℃延伸反應2 min，進行30個循環(huán)，12℃冷卻恒定，之后樣品轉至－20℃保存，聚合酶鏈式反應（PCR）產物用10 g·L－1瓊脂糖凝膠電泳進行分離分析。

取5 μL加有溴酚藍的PCR產物，經瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察、拍照，檢測有擴增帶后回收送生物公司測序，DNA序列測序由南京金斯瑞生物技術有限公司完成。測序完成后，將獲得的細菌16S rDNA序列在www.ebi.ac.uk進行同源性序列檢索，選擇同源性高的典型菌株16S rDNA序列作為參比對象，確定菌株的分類地位[19]。

2 結果與分析

2.1 線蟲和細菌分離結果

從獲得的2個美國木塊樣本中分離得到2個線蟲蟲株，形態(tài)學觀察確定分離獲得的2個線蟲蟲株都是松材線蟲，分別標記為Am-Bx1和Am-Bx2。從Am-Bx1上分離得到6株細菌，分別標記為MG1，MG2，MG3，MG4，MG5和MG6，各種細菌在同一個平板培養(yǎng)基上出現的菌落數分別為15（4.8%），4（1.2%），56（16.3%），87（25.4%），136（39.7%）和 45（13.1%）；從 Am-Bx2上分離得到 4株細菌，分別標為MG7，MG8，MG9和MG10，各種細菌在同一個平板培養(yǎng)基上出現的菌落數分別為34（11.4%），136（45.5%），125（41.8%）和4（1.3%）。由此可確定MG4，MG5，MG8和MG9等4個菌株為優(yōu)勢菌株。

2.2 細菌無細胞培養(yǎng)液產毒測定結果

為了解細菌的產毒能力，用細菌無細胞培養(yǎng)液對1月生黑松無菌切根苗進行生物毒性測定，結果見表1。細菌無細胞培養(yǎng)液處理第3天后對松苗都表現出不同程度的毒害作用，而不同的細菌培養(yǎng)液的毒性強弱不一。其中中國線蟲攜帶的幾株優(yōu)勢細菌YG1，YG2，YG3和YG4培養(yǎng)液對松苗具有較強的毒性作用，在第4天至第6天就引起松苗萎蔫；美國線蟲攜帶的優(yōu)勢細菌MG4，MG5，MG8和MG9的培養(yǎng)液表現出較弱的毒性，分別在第9天之后萎蔫；而用滅菌水與未接菌的空白培養(yǎng)基處理的對照組2周后仍未出現萎蔫。

表1 不同細菌無細胞提取液處理松苗后的表現Table1 Wilted situation of pine seedlings treated with bacterial cell-free filtrate

2.3 細菌與線蟲混合接種致病性測定結果

用各細菌菌株和無菌線蟲混合懸浮液接種黑松無菌苗，測定各優(yōu)勢細菌的致病性，結果見表2。其中，中國線蟲攜帶的優(yōu)勢細菌熒光假單胞菌為強致病性細菌，在接種1～2周內松苗均出現不同程度的萎蔫狀態(tài)；美國線蟲攜帶的幾株優(yōu)勢菌的致病性較弱，在接種1周后幾乎沒有變化，2周后松苗才出現部分萎蔫（圖1～2）。在2種對照中，接種野生線蟲的松苗在2周內出現枯萎，并在第17天整株萎蔫，而接種無菌線蟲的松苗在1個月內仍沒表現出萎蔫。

表2 細菌與無菌線蟲混合接種黑松苗1周后發(fā)病情況Table2 Wilted situation of pine seedlings treated with mixture of bacterium and pine wood nematodes after 7 days

圖1 MG8和YG3無細胞提取物處理4 d后的松苗表現Figure1 Effects of pine seedlings treated with MG8 and YG3 cell-free filtrate

圖2 MG9和YG3無細胞提取物處理4 d后的松苗表現Figure2 Effects of pine seedlings treated with MG9 and YG3 cell-free filtrate

2.4 細菌鑒定結果

細菌在牛肉膏蛋白胨瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)24～36 h后，觀察供試細菌菌落形態(tài)。菌株的革蘭氏染色結果及菌體的詳細特征見表3。

表3 細菌革蘭氏染色及形態(tài)特征Table3 Gram dyeing and cell morphology of bacteria

以MG4，MG5，MG8和MG9的基因組為模板，用16S rDNA通用引物擴增，得到約1500 bp PCR產物。把擴增產物送至南京金斯瑞生物技術有限公司測序，得到了MG4，MG5，MG8和MG916S rDNA長度分別為1307 bp，1307 bp，1322 bp，1448 bp的片段。將獲得的4株細菌的16S rDNA序列在網頁上進行比對，其中與MG4菌株的16S rDNA的序列相似度最高的菌株是代夫特菌Delftia tsuruhatensis，相似度為100%；與MG5菌株的16S rDNA的序列相似度最高的菌株為惡臭假單胞菌Pseudomonas putida，相似度為99.9%；與MG8菌株的序列相似度最高的菌株是嗜麥芽宅食單胞菌Stenotrophomonas maltophilia，相似度為100%；與MG9菌株的序列相似度最高的菌株是泛菌屬Pantoea的2個種——成團泛菌Pantoea agglomerans和菠蘿泛菌Pantoea ananatis，其相似度均為99%，所以該菌株暫不能確定到種。

3 小結與討論

自1982年松材線蟲傳入中國以后，其致病性發(fā)生了很大變化。表現在對馬尾松Pinus massoniana的致病性增強和對雪松Cedrus deodara致病性減弱等方面。最先報道松材線蟲對馬尾松是弱致病的，而后來發(fā)現中國馬尾松卻是主要感病樹種[9-10]；雪松在日本是感病的而在中國是免疫的[17-18]。這些變化唯一能解釋的原因可能就是附著在松材線蟲體表的細菌發(fā)生了演替。從線蟲體表細菌分離結果也能看出，在日本松材線蟲體表主要致病菌為幾種芽孢桿菌[8，19]，而在中國則主要是假單孢桿菌[4，20]。這些現象都說明，松材線蟲體表細菌的確存在演替現象，而美國松材線蟲體表細菌很可能是長期演替的結果。

如果把美國菌株釋放到林區(qū)，利用美國菌株具有的演替能力強和致病性弱等特點，就有可能逐漸替代中國致病性強的細菌，加速中國松林內微生物的演替過程，達到生物防治的目的。要達到此生防目的，首要的問題是弄清美國細菌菌株的產毒能力和致病性，只有產毒能力和致病性都很低的菌株，在生防中才不至于產生負面影響，才有可能在病害控制中發(fā)揮作用。MG4，MG5，MG8和MG9是南京林業(yè)大學病理實驗室從美國線蟲蟲株體表分離的優(yōu)勢細菌菌株，和中國致病性強的幾個菌株比較，不管從產毒能力還是從致病性上比較，都相對較弱。尤其MG9菌株，在產毒能力和致病性方面都表現很好，可以作為生防菌的候選菌株進行后續(xù)研究。第2個問題是所篩選的細菌需要具備替代其他致病菌的功能。美國是松萎蔫病發(fā)生的原產地，松材線蟲體表細菌經過了長時間進化，那么目前美國松材線蟲體表的細菌可能是經過長期進化的結果。如果我們篩選的細菌菌株屬于美國線蟲體表細菌進化的產物，那么這些（或這個）菌株就一定同時具有致病性弱和替代能力強雙重功能。在本研究中僅測定了4個優(yōu)勢菌株的毒性和致病性，而各菌株的繁殖能力，野外生存能力，替代其他細菌能力等還有待進一步測定。

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