p73基因表達(dá)模式對(duì)于HeLa細(xì)胞萘醌類化療藥物敏感性的影響

胡曉鵑 徐靈均

1. 南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，江西 南昌330006；2.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化科，江西 南昌 330006

p73基因表達(dá)模式對(duì)于HeLa細(xì)胞萘醌類化療藥物敏感性的影響

胡曉鵑1徐靈均2

1. 南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，江西 南昌330006；2.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化科，江西 南昌 330006

背景與目的：p73基因的表達(dá)，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及治療轉(zhuǎn)歸各方面均具有十分重要的意義。本研究旨在探討HeLa細(xì)胞p73基因表達(dá)模式對(duì)于該細(xì)胞萘醌類化療藥物(2,3-dichloro-5,8-dihydroxy-1,4-naphthoquinone，DDN)敏感性的影響。方法：運(yùn)用TAp73(transcriptional active p73)特異性反義寡核苷酸干預(yù)HeLa細(xì)胞內(nèi)p73基因表達(dá)模式，以RT-PCR法驗(yàn)證干預(yù)效果，同時(shí)觀察細(xì)胞對(duì)于DDN藥物敏感性的變化；運(yùn)用MTT和TUNEL法分別檢測(cè)在DDN藥物作用下細(xì)胞活力以及凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)的變化情況。結(jié)果：TAp73特異性反義寡核苷酸特異性阻遏細(xì)胞TAp73的表達(dá)、下調(diào)TAp73/DNp73(dominant negative p73)表達(dá)比，從而明顯降低HeLa細(xì)胞對(duì)于DDN的敏感性，導(dǎo)致該藥物抑制細(xì)胞增殖以及誘導(dǎo)凋亡效能均顯著下降(P均＜0.01)。相關(guān)性分析表明TAp73/DNp73的表達(dá)比與細(xì)胞活力呈負(fù)相關(guān)(r=-0.410，P＜0.01)；而TAp73/DNp73表達(dá)比與AI呈正相關(guān)(r=0.635，P=0.019)。結(jié)論：細(xì)胞內(nèi)TAp73/DNp73表達(dá)比的變化對(duì)于調(diào)節(jié)HeLa細(xì)胞增殖以及凋亡具有重要的意義，針對(duì)該表達(dá)比的人工干預(yù)可明顯影響HeLa細(xì)胞對(duì)于DDN藥物的敏感性。

TAp73/DNp73表達(dá)比； 增殖抑制； 凋亡

p73基因自1997年在cos細(xì)胞中被偶然發(fā)現(xiàn)以來(lái)，作為p73家族的重要成員，一直受到廣泛關(guān)注［1］。p73的表達(dá)產(chǎn)物可因羧基或氨基端的選擇性剪接而產(chǎn)生不同的亞型。羧基端的選擇性剪接造成的9種剪切異構(gòu)體(α、β、γ、δ、ε、ζ、η、η1、θ)均由位于第一外顯子的啟動(dòng)子1啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄［2］，由于具有與p73相類似的轉(zhuǎn)錄激活功能，被統(tǒng)稱為TAp73(transcriptional active p73)；而之后相繼被發(fā)現(xiàn)的氨基端截?cái)喈悩?gòu)體，如p 73Δex2、p73Δex2/3、ΔN-p73、ΔNp73等，往往由位于第三外顯子的啟動(dòng)子2啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，由于轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(TA區(qū))缺失或不完整，統(tǒng)稱為DNp73(dominant negative p73)［3-4］。目前認(rèn)為該基因的表達(dá)是一種“two gene in one”的模式［5-6］。

Vilgelm等［7］的研究證實(shí)，在腫瘤發(fā)生以及腫瘤耐藥的過(guò)程中，p73基因表達(dá)模式(TAp73/DNp73表達(dá)比)的變化比單純某一亞型表達(dá)水平的改變更有意義。甲萘醌(Vitamin K3)的新型類似物萘醌類藥物(2,3-dichloro-5,8-dihydroxy-1,4-naphthoquinone，DDN)，在體內(nèi)以及體外實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出廣譜的抗腫瘤作用。由于其具有較多柔比星、絲裂霉素C等其他醌型結(jié)構(gòu)化療藥物更低的生物毒性作用［8］，因此被認(rèn)為是最具潛力的生長(zhǎng)抑制劑和凋亡誘導(dǎo)劑之一。目前對(duì)于DDN抗腫瘤作用的分子機(jī)制尚不清楚，Kang等［9］報(bào)道在DDN作用下細(xì)胞內(nèi)p73β的表達(dá)水平有所提高，并且p21、Bax的表達(dá)也呈p73依賴性模式。本研究小組之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在DDN導(dǎo)致細(xì)胞增殖抑制并發(fā)生凋亡的過(guò)程中，TAp73/DNp73表達(dá)比顯著上調(diào)［10］。本研究旨在進(jìn)一步探討針對(duì)HeLa細(xì)胞內(nèi)p73表達(dá)模式的人為干預(yù)，對(duì)該細(xì)胞DDN藥物敏感性是否存在影響。

1 材料和方法

1.1 材料

DDN為美國(guó)Aldrich-Sigma公司生產(chǎn)；TRIzoTMReagent(總RNA提取試劑)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；小牛血清購(gòu)自杭州四季青公司；逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV、Rnasin、dNTP及TUNEL試劑盒(DeadEndTMColorimetric TUNEL System)均購(gòu)自美國(guó)Promega公司；DNA 聚合酶LA Taq購(gòu)自大連寶生物工程公司；MTT購(gòu)自上海普飛生物技術(shù)公司；寡核苷酸鏈由上海捷倍思基因技術(shù)有限公司合成；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 寡核苷酸的設(shè)計(jì)與合成

由GenBank中獲取目的基因全序列，自行設(shè)計(jì)(表1)，經(jīng)GenBank同源檢測(cè)，未見(jiàn)與人類其他基因序列有同源性。寡核苷酸鏈均經(jīng)硫代磷酸化修飾，PAGE純化，凍干分裝，-20 ℃保存。按脂質(zhì)體LipofectamineTM2000說(shuō)明書操作，以DMEM培養(yǎng)基分別稀釋脂質(zhì)體以及各寡核苷酸鏈，使用前將各備用液充分混合。

表 1 寡核苷酸鏈堿基序列Tab. 1 Sequences of oligonucleotides

1.3 細(xì)胞處理與分組

將常規(guī)培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞分為4組：空白對(duì)照組、DDN藥物單獨(dú)處理組(依據(jù)本研究小組之前的研究結(jié)果［10］，選取15 μmol/L DDN為作用濃度)、反義組(15 μmol/L DDN+3條對(duì)應(yīng)于不同位置的反義寡核苷酸、錯(cuò)義組(15 μmol/L DDN+錯(cuò)義寡核苷酸)，處理24 h后備用。

1.4 RT-PCR法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)TAp73/DNp73表達(dá)比

細(xì)胞總RNA提取，采用TRIzol試劑按其說(shuō)明操作，所提取的總RNA溶解后用紫外分光光度儀測(cè)D260/280值，計(jì)算RNA純度和濃度，通過(guò)甲醛變性凝膠電泳觀察28S、18S帶以檢查RNA有無(wú)降解；cDNA合成，采用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，按其說(shuō)明書操作；PCR擴(kuò)增，由GenBank獲取目的基因全序列，利用Primer Premier 5.0軟件自行設(shè)計(jì)引物，其序列分別為：TAp73正義引物5’-CACCACGTTTGAGCACCTCT-3’，反義引物5’-GGCGATCTGGCAGTAGAGTTT-3’，全長(zhǎng)共4 3 3 b p；D N p 7 3正義引物5’-CGAAAATGCCAACAAACGG-3’，反義引物5’-GGAGCAGACTGTCCTTCGTTG-3’，全長(zhǎng)共6 7 6 b p；β-a c t i n正義引物5’-CTTCCTGGGCATGGAGTC-3’，反義引物5’-GCCGATCCACACGGAGTA-3’，全長(zhǎng)共232 bp。反應(yīng)以多重PCR方式，運(yùn)用LA Taq酶，同時(shí)擴(kuò)增內(nèi)對(duì)照β-actin以及目的基因TAp73或DNp73。循環(huán)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共22循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。 取20 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖(含溴化乙錠5 μg/mL)電泳，通過(guò)FR200圖像分析軟件(上海復(fù)日公司)讀取目的電泳條帶的斑點(diǎn)密度掃描值，以各組β-actin條帶的掃描值標(biāo)化其相應(yīng)組的TAp73或DNp73基因的表達(dá)量，再以各組TAp73與DNp73基因表達(dá)的相對(duì)比值作為各組間相互比較的參數(shù)。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率

以每孔1×104個(gè)HeLa細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，分組處理24 h后，加入新配制的MTT液每孔20 μL，置37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)溫育4 h；吸去上清液，加入二甲基亞砜150 μL，在振蕩器上輕輕振蕩10 min；用酶標(biāo)儀于490 nm處測(cè)量吸光度(D)。細(xì)胞相對(duì)活力的計(jì)算，根據(jù)公式：細(xì)胞相對(duì)活力=(D實(shí)驗(yàn)組-D調(diào)零孔)/(D空白對(duì)照組-D調(diào)零孔)×100%。

1.6 TUNEL法測(cè)定細(xì)胞凋亡指數(shù)

運(yùn)用DeadEndTMColorimetric TUNEL System，按其說(shuō)明操作。DAB顯色后，以蘇木素進(jìn)行細(xì)胞核復(fù)染，高倍鏡(400×)下隨機(jī)選擇5～10視野，每個(gè)視野計(jì)100～200個(gè)細(xì)胞計(jì)算凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)。AI=凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)采用SPSS 18.0軟件，針對(duì)各組參數(shù)進(jìn)行組間方差分析；同時(shí)考量指標(biāo)間(即TAp73/DNp73表達(dá)比與細(xì)胞相對(duì)活力、TAp73/DNp73表達(dá)比與細(xì)胞AI的)相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

為了明確細(xì)胞內(nèi)p73基因表達(dá)模式變化對(duì)于細(xì)胞DDN藥物敏感性是否存在影響，本研究在以DDN藥物處理的同時(shí)，運(yùn)用3條針對(duì)不同部位的TAp73特異性反義寡核苷酸進(jìn)行p73基因表達(dá)模式的人為干預(yù)，并以錯(cuò)義寡核苷酸干預(yù)組和DDN藥物單獨(dú)處理組為對(duì)照。RTPCR法驗(yàn)證此法可特異性阻遏TAp73表達(dá)、下調(diào)TAp73/DNp73表達(dá)比，各組TAp73/DNp73表達(dá)比分別為0.018 7±0.036 6(反義組)、8.837 5±0.901 2(錯(cuò)義組)、9.411 4±1.174 2(DDN單獨(dú)處理組)，組間方差分析顯示，反義組與錯(cuò)義組及DDN單獨(dú)處理組之間差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而錯(cuò)義組與DDN單獨(dú)處理組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖1)。

TAp73特異性反義寡核苷酸對(duì)于DDN抑制細(xì)胞增殖以及凋亡誘導(dǎo)的效應(yīng)均有一定程度阻遏效應(yīng)，降低細(xì)胞對(duì)于藥物的敏感性。細(xì)胞相對(duì)活力反義組為(38.10±8.01)%、錯(cuò)義組為(12.10±3.82)%、DDN單獨(dú)處理組為(18.00±4.80)% (圖2)；TUNEL檢測(cè)AI反義組為(29.00±3.02)%、錯(cuò)義組為(71.50±3.55)%、DNN單獨(dú)處理組為(72.75±3.6 9)%、空白處理組為(2.86±0.30)%(圖3)。組間方差分析顯示反義組與錯(cuò)義組及DDN單獨(dú)處理組之間細(xì)胞相對(duì)活力以及AI差異均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而錯(cuò)義組與DDN單獨(dú)處理組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

為考量TAp73/DNp73表達(dá)比變化與HeLa細(xì)胞對(duì)于DDN藥物細(xì)胞增殖抑制以及凋亡誘導(dǎo)兩方面生物效應(yīng)的敏感性是否存在相關(guān)性，本研究進(jìn)行了各指標(biāo)間的相關(guān)性分析：TAp73/DNp73表達(dá)比與細(xì)胞增殖力之間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.410，P<0.01)；而與AI呈正相關(guān)(r=0.635，P<0.01)。

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HeLa細(xì)胞內(nèi)p73基因表達(dá)模式對(duì)于其細(xì)胞活力以及凋亡過(guò)程有著十分重要的意義；針對(duì)p73基因表達(dá)模式的人為干預(yù)可明顯改變細(xì)胞DDN化療藥物的敏感性。

3 討 論

本研究小組之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DDN具有較好的抑制HeLa細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡的抗腫瘤活性，并且在此過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)TAp73 mRNA水平增高，TAp73/DNp73表達(dá)比明顯上調(diào)［10］。有研究發(fā)現(xiàn)，在針對(duì)惡性腫瘤的化學(xué)治療過(guò)程中，p73基因表達(dá)模式往往發(fā)生明顯變化：喜樹(shù)堿、VP16、順鉑、多柔比星以及紫杉醇等一線腫瘤化療藥物往往都能引起細(xì)胞內(nèi)TAp73的水平增高［11］，這些都與本研究結(jié)果相吻合。為了進(jìn)一步探討TAp73/DNp73表達(dá)比變化與細(xì)胞增殖及凋亡轉(zhuǎn)歸之間的相關(guān)性，本研究以反義寡核苷酸特異性抑制TAp73表達(dá)，觀察HeLa細(xì)胞對(duì)于DDN藥物敏感性的變化。

以TAp73特異性反義寡核苷酸作用后，HeLa細(xì)胞內(nèi)TAp73 mRNA水平被特異性降低，TAp73/DNp73表達(dá)比倒置。由此說(shuō)明采用反義寡核苷酸技術(shù)可以有效地特異性阻遏p73某一類亞型的表達(dá)，是一種較為簡(jiǎn)便且成本較低的人為改變細(xì)胞內(nèi)p73基因表達(dá)模式的策略。

通過(guò)與DDN藥物單獨(dú)處理組以及錯(cuò)義寡核苷酸對(duì)照組相對(duì)比，反義寡核苷酸特異性抑制TAp73表達(dá)后，HeLa對(duì)于DDN藥物的敏感性明顯下降。該藥物抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用均顯著受到干擾。相關(guān)性分析表明TAp73/DNp73表達(dá)比的改變與細(xì)胞增殖以及凋亡的轉(zhuǎn)歸有一定關(guān)聯(lián)。另外，一些臨床證據(jù)表明，DNp73的局部表達(dá)可引發(fā)化療藥物耐藥［12-14］，由此征示著TAp73與DNp73作為同一個(gè)基因的兩類產(chǎn)物，彼此之間有著非常密切的關(guān)聯(lián)性，相互影響共同調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與凋亡過(guò)程。

許多抑癌蛋白在細(xì)胞增殖與凋亡的過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，如p53和TAp73，為避免細(xì)胞過(guò)度凋亡，機(jī)體對(duì)于TAp73和p53的功能也有著嚴(yán)密的調(diào)節(jié)機(jī)制。有研究表明，在DNp73中的ΔNp73啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)現(xiàn)p53相關(guān)元件，它含有3個(gè)半結(jié)合位點(diǎn)，位于帽子結(jié)構(gòu)-78至-47［4］。與此相類似，TAp73也可通過(guò)結(jié)合位于ΔNp73啟動(dòng)子序列-76到-57的TAp73特異性元件，激活內(nèi)源性ΔNp73的轉(zhuǎn)錄［15］。由此，p53和TAp73可結(jié)合ΔNp73啟動(dòng)子序列以誘導(dǎo)其表達(dá)；而DNp73又反過(guò)來(lái)通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制以及形成寡聚體的方式，阻遏p53和TAp73針對(duì)各下游基因(包括其自身)的轉(zhuǎn)錄激活作用［4,16］，以此形成一個(gè)負(fù)反饋環(huán)，確保對(duì)于p53和TAp73功能的準(zhǔn)確調(diào)控。

值得注意的是，p53/TAp73的拮抗劑過(guò)度表達(dá)往往可導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生，如MDM2［17］。DNp73由于能使p53和TAp73的抑癌作用失活，而被認(rèn)為可能也與腫瘤的發(fā)生有著一定的關(guān)聯(lián)［18］。在乳腺癌以及外陰鱗癌等多種腫瘤組織中DNp73均呈過(guò)表達(dá)狀態(tài)［19-20］；在大多數(shù)的腫瘤細(xì)胞株中，TAp73/DNp73的表達(dá)比值均與正常組織或胎兒組織不同［4］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TAp73特異性缺失的小鼠可出現(xiàn)自發(fā)性腫瘤［21］，而p73基因敲除的小鼠未出現(xiàn)此現(xiàn)象［22］。由此表明對(duì)于細(xì)胞的惡變、增殖與凋亡，TAp73與DNp73兩類異構(gòu)體的表達(dá)相對(duì)量遠(yuǎn)比單一異構(gòu)體的絕對(duì)量更為重要。

同時(shí)，我們也應(yīng)看到即便將TAp73 mRNA水平降至極低的水平，DDN對(duì)于HeLa細(xì)胞的抑制作用依然存在，細(xì)胞相對(duì)活力為(18.0±4.8)%；AI為(29.0±3.0)%，與空白對(duì)照組相比仍有顯著性差異。這表明細(xì)胞凋亡與增殖的調(diào)控是一個(gè)多途徑共同參與的過(guò)程，而DDN藥物抗腫瘤機(jī)制也可能同時(shí)涉及多個(gè)靶點(diǎn)。

p73基因表達(dá)模式的變化可顯著改變細(xì)胞對(duì)于化療藥物DDN的敏感性，并影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸。由此在臨床診療過(guò)程中，針對(duì)化療藥物耐藥的腫瘤病例，p73基因表達(dá)模式將有可能作為一個(gè)重要的作用靶點(diǎn)，增強(qiáng)腫瘤的藥物敏感性，以此為多種化療藥物聯(lián)合治療提供新的思路。

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The impact ofp73gene expression pattern on HeLa cell’s sensitivity to a naphthoquinone analog

HU Xiao-juan,XU Ling-jun(Department of Biochemistry and Molecular Biology, Medical College of Nanchang University, Nanchang Jiangxi 330006, China)

HU Xiao-juan E-mail：huxiaojuan@163.com

Background and purpose：The expression ofp73gene is of great importance in both carcinogenesis and chemotherapy sensitivity. The purpose of this study was to investigate the impact ofp73gene expression pattern on HeLa cell’s sensitivity to a naphthoquinone analog, termed 2,3-dichloro-5,8–dihydroxy-1,4-naphthoquinone(DDN).Methods：TAp73-specific antisense oligonucleotide was applied to interfere HeLa cellularp73gene expression pattern. The effect of antisense oligonucleotide was certified by RT-PCR. Meanwhile, the sensitivity of HeLa to DDN’s proliferation inhibition and apoptosis induction was monitored. Cell viability and apoptosis index were measured by MTT and TUNEL respectively, after TAp73-specific antisense oligonucleotide and DDN treatment.Results：The antitumor activity of DDN, both growth inhibition and apoptosis induction, could be obviously but partly blocked by the intervention of TAp73-specific antisense oligonucleotide. The cell viability and apoptosis index were closely related to the cellular expression ratio of TAp73/DNp73 (r=-0.410,P＜0.01;r=0.635,P=0.019, respectively).Conclusion：The expression ratio of TAp73/DNp73 is important for HeLa cell’s proliferation and apoptosis. Changes inp73gene expression pattern interferes the sensitivity of HeLa cell to DDN.

Expression ratio of TAp73/DNp73; Growth inhibition; Apoptosis

10.3969/j.issn.1007-3969.2012.02.006

R73-36+1

A

1007-3639(2012)02-0108-06

江西省教育廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(No：GJJ08092)；南昌大學(xué)科研基金(2008)。

胡曉鵑 E-mail:huxiaojuan@163.com

2011-09-19

2011-12-22）