蒸餾水與稀釋碘伏對結(jié)腸癌細(xì)胞SW480體外增殖的比較研究

龐秋霞，王愛紅，劉勇峰，許靜洪，陳美霓，趙菊梅＃

（1.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院，延安716000；2.延安大學(xué)附屬醫(yī)院）

蒸餾水與稀釋碘伏對結(jié)腸癌細(xì)胞SW480體外增殖的比較研究

龐秋霞1，王愛紅1，劉勇峰2，許靜洪1，陳美霓1，趙菊梅1＃

（1.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院，延安716000；2.延安大學(xué)附屬醫(yī)院）

目的研究蒸餾水與稀釋碘伏對人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480體外增殖的抑制作用。方法體外培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480，分別用蒸餾水與不同濃度稀釋碘伏（0.05%，0.025%，0.01%）處理，MTT（噻唑藍(lán)）法檢測蒸餾水與稀釋碘伏對SW480細(xì)胞的生長影響作用，并進行分析評價。結(jié)果0.01%碘伏處理細(xì)胞1 min即可表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性作用，效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單純使用蒸餾水的殺傷作用。結(jié)論稀釋碘伏在體外對人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的殺傷作用明顯高于單純使用蒸餾水，可望為臨床手術(shù)中控制腹腔結(jié)腸癌細(xì)胞種植轉(zhuǎn)移提供臨床依據(jù)。

結(jié)腸癌；腹腔灌洗

結(jié)腸癌是發(fā)生于結(jié)腸部位的常見的消化道惡性腫瘤，占胃腸道腫瘤的第3位，嚴(yán)重危害人類的健康。目前結(jié)腸癌的治療首先強調(diào)手術(shù)切除，但是手術(shù)過程中癌細(xì)胞的脫落、種植是影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的主要原因之一，因此探索手術(shù)治療中防范癌細(xì)胞播散、種植的有效措施是非常必要的。目前研究者也嘗試這方面的研究，并取得了一定的成績［1-4］。本實驗研究蒸餾水與稀釋碘伏對結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480的體外增殖抑制情況并進行對比分析，以期探尋一種理想的術(shù)中腹腔灌洗措施。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、試劑與儀器

人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480、RPMIl640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、二甲亞砜、MTT、Bio-Rad680型全自動酶標(biāo)儀。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 將上述細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含15%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基中（含100U／ml青霉素、100μg／ml鏈霉素），置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱，待細(xì)胞長滿瓶底后，常規(guī)分瓶培養(yǎng)。

1.2.2 光鏡形態(tài)學(xué)觀察蒸餾水與稀釋碘伏對SW480體外增殖的影響 收集對數(shù)生長期細(xì)胞，RPIM-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為1×105／ml，接種在放有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期，分別加入蒸餾水與不同濃度（0.05%，0.025%，0.01%）稀釋碘伏繼續(xù)培養(yǎng)；對照組正常RPIM-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，10 min后鏡下觀察。

1.2.3 MTT法檢測蒸餾水與稀釋碘伏對SW480體外增殖的影響 取對數(shù)生長期的SW480細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，RPIM-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為1×105／ml，以100μl／孔接種于96孔板，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱孵育24 h后，分別加入蒸餾水和不同濃度（0.05%，0.025%，0.01%）稀釋碘伏，每一處理組均設(shè)6個復(fù)孔，同時以RPIM-1640培養(yǎng)液為對照組，作用5 min后將細(xì)胞用PBS清洗，加入20μl 5.0 g·L-1的MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去含MTT的培養(yǎng)基，每孔加入150μl二甲亞砜（DMSO），振蕩15 min，至紫色結(jié)晶物充分融解后，選擇490 nm波長，在酶標(biāo)儀上測定各孔的吸光度值（A490），以未處理細(xì)胞的吸光值作為對照，計算各組細(xì)胞的生長抑制率（IR）∶IR＝（1-實驗組平均A490值／對照組平均A490值）100%。

1.2.4 蒸餾水與稀釋碘伏處理不同時間對SW480的抑制作用 收集對數(shù)生長期細(xì)胞（方法同上），用蒸餾水處理作用5、10、15 min，0.01%稀釋碘伏作用1、3、5 min后，MTT檢測其對細(xì)胞的抑制作用，分析其A490值的變化和細(xì)胞生長抑制率的變化。以時間變化為橫軸，細(xì)胞生長抑制率為縱軸繪制曲線圖。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件。組間比較用t檢驗，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 光鏡形態(tài)學(xué)觀察

陰性對照組SW480細(xì)胞生長良好，細(xì)胞伸展，呈不規(guī)則多角形。碘伏組培養(yǎng)2 min后，細(xì)胞明顯皺縮，漿內(nèi)出現(xiàn)空泡，胞內(nèi)顆粒增多，培養(yǎng)液中有許多漂浮的呈桑葉狀細(xì)胞，6 min時細(xì)胞全部死亡。蒸餾水組培養(yǎng)10 min后，細(xì)胞數(shù)目開始減少，20 min后細(xì)胞明顯減少，30 min后幾乎全部死亡。

2.2 MTT法檢測蒸餾水與稀釋碘伏對SW480體外增殖的影響

通過MTT比色法我們觀察了蒸餾水與稀釋碘伏處理細(xì)胞5 min后的細(xì)胞抑制率，結(jié)果顯示不同濃度稀釋碘伏均呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞增殖抑制作用（P＜0.05），效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單純使用蒸餾水的細(xì)胞殺傷作用，且不同濃度的稀釋碘伏對SW480的抑制作用差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；而蒸餾水組與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），（見表1）。

表1 蒸餾水與稀釋碘伏對SW480體外增殖的影響（s）

表1 蒸餾水與稀釋碘伏對SW480體外增殖的影響（s）

組 別 SW480 A490值 抑制率（%）1.133±0.070蒸餾水組 0.912±0.051 19.5±1.11碘 0.05% 0.182±0.004 84.0±0.91伏 0.025% 0.178±0.003 84.3±0.95組對照組0.01% 0.176±0.006 84.5±1.03

2.3 0.01%稀釋碘伏處理不同時間對SW480的抑制作用

0.01 %碘伏處理對數(shù)生長期的細(xì)胞，分別作用1、3、5 min后，MTT檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.01%碘伏明顯抑制細(xì)胞的生長，抑制率84.0%，而且不同時間對SW480的抑制作用差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），與對照組比較顯示出明顯的抑制作用（P＜0.01）（見表2）。

表2 0.01%碘伏不同時間對SW480的影響（s）

表2 0.01%碘伏不同時間對SW480的影響（s）

時間（min）SW480 A490值實驗組 對照組 抑制率（%）1 0.187±0.003 1.121±0.058 83.3±1.18 3 0.171±0.005 1.127±0.070 84.8±2.13 5 0.162±0.006 1.130±0.047 85.7±1.23

2.4 蒸餾水作用不同時間對SW480的抑制作用

蒸餾水對SW480細(xì)胞不同時間段均有不同程度的抑制作用。在5 min內(nèi)，蒸餾水對腫瘤細(xì)胞抑制率無顯著性差異（P＞0.05）。隨著時間的延長，蒸餾水對腫瘤細(xì)胞的抑制率逐漸增高，在10 min、15 min其腫瘤細(xì)胞抑制率均高于對照組且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。不同時間段蒸餾水對SW480細(xì)胞的抑制作用隨觀察時間的延長的變化情況如圖1所示。

圖1 蒸餾水不同作用時間對SW480生長作用的影響

3 討論

結(jié)腸癌治療是以外科手術(shù)為主的綜合治療，其中手術(shù)治療在結(jié)腸癌的治療中目前仍占主導(dǎo)地位。但是手術(shù)過程中癌細(xì)胞的脫落、種植是導(dǎo)致腹腔惡性腫瘤術(shù)后早期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要因素，嚴(yán)重影響了患者的預(yù)后。因此，術(shù)中有效地腹腔灌洗措施可以防止癌細(xì)胞醫(yī)源性播散并提高療效。目前，在預(yù)防和治療胸腹腔內(nèi)惡性腫瘤轉(zhuǎn)移或術(shù)中種植時，經(jīng)常應(yīng)用蒸餾水或生理鹽水沖洗［1-3］，并且取得了顯著療效。

蒸餾水是一種不含雜質(zhì)和有形成分的低滲性液體，其滲透壓接近0，而人體組織細(xì)胞滲透壓為280-310 OSM，由于滲透壓的差異，蒸餾水可以使腫瘤細(xì)胞腫脹、破裂，裂解腫瘤細(xì)胞膜，從而使腫瘤細(xì)胞失去活性。Emmanuel［4］等研究蒸餾水對結(jié)直腸癌手術(shù)過程中腹腔脫落腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，發(fā)現(xiàn)蒸餾水作用細(xì)胞14 min可以引起細(xì)胞裂解，而在體內(nèi)，腹腔分泌物的污染使灌洗液產(chǎn)生一個50 mm的滲透壓，連續(xù)沖洗可以使灌洗液的滲透壓減低到10 mm，約32 min后可以全部殺死腹腔脫落的腫瘤細(xì)胞，但是由于這種方法需要的時間長而不適合應(yīng)用于實踐操作中。

稀釋碘伏腹腔灌洗能明顯降低腹部腫瘤種植播散的發(fā)生，而且其作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過生理鹽水的灌洗作用，可以安全有效地應(yīng)用于大腸癌手術(shù)操做中，減少術(shù)后感染性并發(fā)癥，降低癌癥復(fù)發(fā)［5］。Favoulet［6］等研究稀釋碘伏對體外結(jié)腸癌細(xì)胞的毒性作用及其對腹腔腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用，用1%碘伏作用人及大鼠的結(jié)腸癌細(xì)胞10 min后，細(xì)胞全部死亡，而且動物模型顯示，1%稀釋碘伏沖洗腹腔完全抑制了壁層腹膜腫瘤的生長。提示術(shù)中稀釋碘伏腹腔灌洗將可能是理想的防止癌細(xì)胞醫(yī)源性播散方法之一。

本實驗選用蒸餾水和不同濃度碘伏（0.5%，0.25%，0.01%）作用結(jié)腸癌細(xì)胞SW480，比較稀釋碘伏與蒸餾水對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，以期選擇更為理想的術(shù)中腹腔灌洗方法，結(jié)果顯示，稀釋碘伏短時間內(nèi)即產(chǎn)生明顯的細(xì)胞殺傷作用，0.01%碘伏處理細(xì)胞1 min即可表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性作用，效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單純使用蒸餾水的殺傷作用，該實驗結(jié)果可以作為臨床應(yīng)用的依據(jù)，在結(jié)腸癌手術(shù)時，選擇0.01%的碘伏溶液沖洗浸泡手術(shù)野，既可以減少單純蒸餾水沖洗長時間暴露腹腔的弊端，又能起到殺死術(shù)中脫落的腫瘤細(xì)胞，減少腫瘤復(fù)發(fā)的作用，可望為臨床手術(shù)中控制腹腔結(jié)腸癌細(xì)胞種植轉(zhuǎn)移提供臨床依據(jù)。

［1］馬博，黃三雄，陳誠.直腸癌手術(shù)創(chuàng)面蒸餾水處理的療效觀察［J］.實用腫瘤雜志，2005，20（3）：255-256.

［2］ConstantinidesV A，Cheetham D，NichollsR J，etal Is rectal washout effective forpreventing localized recurrence after anterior resection for rectal cancer［J］.Dis Colon Rectum，2008，51（9）：1339-1344.

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［6］Favoulet P，Benoit L，Guiu B，et al.Evaluation of povidone abdominal washing for prevention of peritoneal cancer cell seeding：experimental study in the rat［J］.Ann Chir.2002，127（8）：600-605.

Com parative study of distilled water and diluted povidone－iodione on grow th of colon cancer cell line SW 480 in vitro

PANGQiu－xia，WANG Ai－h(huán)ong，LIU Yong－feng，XU Jing－h(huán)ong，CHEN Mei－ni，ZHAO Ju－mei

（1.Medical College of Yan'an University；2.First Affiliated Hospital of Yan'an University，Yan'an shaanxi716000，China）

ObjectiveTo study the inhibition effect of distilled water and diluted Povidone－iodione on growth of human colon Cancer cell line SW480M ethods The Colon Cancer cell line SW480 cellswere treated with distilled water and different concentrations（0.05%，0.025%，0.01%）of diluted povidone-iodine，MTT assay was used to examine cellular proliferation.Results SW480 cellswere killed significantly after cells were treated by 0.01%povidone－iodine for about1 min，The killing effect of0.01%povidone－iodine ismuch higher than the pure distilled water.ConclusionDiluted povidone-iodine has a significant killing effect on human colon cancer cell SW480 in vitro，which would provide a clinical basis to control abdominalmetastasis of colon cancer cells on clinical surgery.

R735.2

A

1672－2639（2012）01－0001－03

2011-10-20；責(zé)任編輯 徐文梅］

陜西省衛(wèi)生廳科研基金資助項目（2008H039）；延安市科學(xué)技術(shù)研究資助項目（2008ks-30）

＃通訊作者：趙菊梅，E－mail：jmz2003.stu＠163.com