HPLC法同時測定綠茶中表沒食子兒茶素沒食子酸酯和咖啡因的含量

李元宏，田 華，陳吉炎（湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院藥學部，湖北 十堰 442000）

綠茶在我國已有數(shù)千年的應用歷史，因其具有多種生理作用和藥理活性，人們對其研究越來越深入，尤其是綠茶中含量較高、用途廣泛的茶多酚和咖啡因更是如此。茶多酚是一類多羥基酚類化合物的總稱，具有增強機體抵抗力、抗氧化、抗衰老、降血脂、降血糖、降血壓、抑菌、抗癌、抗輻射、抗病毒等重要作用[1，2]，其中以表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）含量最高，占40%～50%[3]?？Х纫蚴且环N生物堿，具有增加腎臟血流量、強心、利尿、興奮神經(jīng)中樞、消除疲勞等作用。筆者以高效液相色譜（HPLC）法同時測定綠茶中EGCC和咖啡因的含量，以利于綠茶的質(zhì)量控制[4]。

1 儀器與試藥

LC-10A型HPLC儀、SPD-10A型紫外檢測器（日本島津公司）；HW-2000型色譜工作站（南京千譜軟件有限公司）；FA2004型電子分析天平（上海精科公司）；KQ-500型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率:150 W，頻率:30 kHz）。

EGCG標準品（美國Sigma公司，純度＞98%）；咖啡因?qū)φ掌罚ㄖ袊称匪幤窓z定研究院，批號:171215-200809）；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。綠茶采自武當山八仙觀茶場，經(jīng)湖北醫(yī)藥學院生藥學教研室陳吉炎教授鑒定為茶Camellia sinensis（L.）O.Ktze.的芽葉。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:DiamonsilTMC18（200mm×4.6mm，5 μm），加裝Phenomenex保護柱；流動相:甲醇-0.1%冰醋酸水溶液（25∶75）；流速:1.0mL·min－1；檢測波長:278 nm[5]；柱溫:30 ℃；進樣量:10μL。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.混合對照品；B.供試品；1.咖啡因；2.EGCGFig 1 HPLC chromatogramsA.substance control；B.test sample；1.caffeine；2.EGCG

2.2 混合對照品溶液的制備

精密稱取經(jīng)真空干燥至恒重的EGCG標準品和咖啡因?qū)φ掌犯鬟m量，用甲醇配成每1mL中含EGCG 25.0mg和咖啡因5.0mg的混合對照品貯備液。精密量取該貯備液10mL，置100mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取綠茶粉末約1.0 g，置于具塞錐形瓶中，加入乙醇25mL，超聲處理30min，濾過，濾渣用適量乙醇洗滌，合并濾液，乙醇定容至50mL，搖勻。精密量取2mL，置蒸發(fā)皿中，揮干，殘渣移入10mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得。

2.4 線性關系考察

精密量取上述混合對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0mL，分別置10mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密吸取10μL，注入HPLC儀，每一濃度重復進樣3次，求平均峰面積。以平均峰面積積分值（Y）為縱坐標，進樣量（X，μg）為橫坐標，進行線性回歸，得EGCG和咖啡因的回歸方程分別為Y＝1.178×107X+5.947×105（r＝0.9994，n＝6）、Y＝2.376×107X－2.278×104（r＝0.9996，n＝6）。結果表明，EGCG和咖啡因的進樣量分別在1.25～10.00、0.25～2.00μg范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好線性關系。

2.5 精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液10μL，重復進樣6次，測定峰面積。結果，EGCG和咖啡因的RSD分別為0.76%和1.02%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗

取同一批號的綠茶粉末（約1.0 g）6份，分別按“2.3”項下方法制成供試品溶液，進樣10μL，測定峰面積。結果，EGCG和咖啡因的RSD分別為1.21%和1.46%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一供試品溶液，分別于0、1、2、4、8、24h各進樣10μL，測定峰面積。結果，EGCG和咖啡因的RSD分別為1.32%和1.63%（n＝6），表明供試品溶液在制備后24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的同一批綠茶粉末（約1.0 g）6份，分別精密加入混合對照品貯備液2mL，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過后，取續(xù)濾液進樣10μL，測定峰面積，計算樣品含量和加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

2.9 樣品含量測定

精密稱取3批綠茶粉末各約1.0 g，分別按“2.3”項下方法制成供試品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過后，取續(xù)濾液進樣10μL，測定峰面積，計算含量，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果（n＝3）Tab 2 Result of content determination of samples（n＝3）

3 討論

樣品含量測定結果表明，不同批次的綠茶中所含的活性成分有一定差異，有的差異還很顯著?？梢?，從有效成分層面來控制綠茶質(zhì)量是不容忽視的問題。

由于綠茶所含成分比較復雜，除含量較高的EGCG和咖啡因外，還含有不少低含量或是弱吸收的成分。因此，用色譜方法來分析和控制綠茶質(zhì)量時，色譜峰的分離度是必須注意的問題。試驗中通過調(diào)整色譜條件使保留時間適當延長，各組分可獲得較好分離。

綜上所述，本方法簡便、準確、重復性好，可用于綠茶的質(zhì)量控制。

[1]袁曄蓉.淺談茶多酚的研究進展[J].中國藥房，2007，18（9）:700.

[2]賈淑平，曾 睿，但衛(wèi)華，等.植物多酚藥理作用的研究及應用[J].中國藥房，2009，20（12）:953.

[3]仉燕崍，李 楠，韓國柱，等.表沒食子兒茶素沒食子酸酯的研究進展[J].中草藥，2006，37（2）:303.

[4]李自勇，喻宗沉，徐小軍，等.茶多酚含量與兒茶素含量關系研究[J].化學與生物工程，2007，24（11）:73.

[5]王菊萍，呂 萍.反相高效液相色譜法測定茶多酚中表沒食子兒茶素沒食子酸酯的含量[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2006，16（15）:2306.