滋腎通絡(luò)方對局灶性腦缺血大鼠腦組織腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子蛋白含量的影響

王華 陳澤濤

缺血性卒中有發(fā)病率高、病死率高、致殘率高、復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)，目前在對神經(jīng)細(xì)胞營養(yǎng)修復(fù)方面無切實(shí)可行的中西藥物，筆者通過多年的臨床觀察，研制出滋腎通絡(luò)方治療本病，取得明顯的效果。

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurophic factor，BDNF)是在腦內(nèi)合成的一種蛋白質(zhì)，它廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，BDNF為一種堿性蛋白質(zhì)，對神經(jīng)元的存活、分化、生長發(fā)育起重要作用；并具有調(diào)節(jié)突觸可塑性和神經(jīng)遞質(zhì)傳遞等功能；同時，能防止神經(jīng)元受損傷死亡、改善神經(jīng)元的病理狀態(tài)、促進(jìn)受損傷神經(jīng)元再生及分化等生物效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組織化學(xué)法觀察局灶性腦缺血大鼠(MCAO)治療后腦組織BDNF的蛋白含量，以判斷滋腎通絡(luò)方對缺血周圍區(qū)神經(jīng)細(xì)胞損傷修復(fù)的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級健康Wistar雄性大鼠，體重250～300克，由山東大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號SCXK魯20030004。攝食飼料為山東大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供的混合飼料，實(shí)驗(yàn)期間自由飲水，室溫18～25 ℃，相對濕度62%～72%。

1.2 方法

1.2.1 MCAO模型大鼠的制備 參照Zea-Longa[1]報(bào)道的頸外動脈栓線法制備局灶性大鼠腦缺血模型。Wistar雄性大鼠用1%戊巴比妥鈉45 mg/kg行腹腔注射麻醉，并取仰位固定；剪去大鼠頸部毛發(fā)后，常規(guī)碘伏消毒頸部皮膚，沿頸部正中切開，鈍性分離皮下組織，從兩側(cè)頜下腺之間剪開淺筋膜，暴露左側(cè)胸鎖乳突肌，鈍性分離胸鎖乳突肌與胸骨舌肌之間的肌間隙，暴露左側(cè)頸總動脈(CCA)，沿此間隙繼續(xù)向上方分離，找到CCA分叉，在頸總動脈深面穿一細(xì)線，鈍性分離頸內(nèi)、外動脈。提起該側(cè)CCA，在接近頸內(nèi)動脈(ICA)與頸外動脈(ECA)分叉處，用眼科剪小心在CCA剪一約0.2 mm的橫切口，將一直徑約0.2 mm的魚鉤線(尼龍線)，穿入ICA，穿線前標(biāo)記從動脈切口到眼外眥的距離，將魚鉤線緩慢穿入至接近標(biāo)記位置，當(dāng)感到有一定阻力時即停止推送，此時栓線進(jìn)入距CCA分叉處約1.8～2.0 cm，頭端正好位于MCA起始部位，阻斷MCA血流，可見大鼠右眼虹膜顏色變淺，出現(xiàn)Honer’s征。然后將切口的遠(yuǎn)心端及動脈內(nèi)的絲線牢固結(jié)扎，剪去多余的絲線，逐層縫合皮膚，局部撒青霉素粉，將栓線的尾端暴露在皮外。術(shù)中及術(shù)后保持室溫25 ℃左右，采用60 W的白熾燈照射動物以維持其肛溫在(37.5±0.3)℃，相當(dāng)于腦溫(37.9±0.4)℃左右。

1.2.2 動物分組 上述Wistar雄性大鼠50只，隨機(jī)分成5組，即模型組、假手術(shù)組、中藥低劑量組、中藥高劑量組、西藥組各10只。假手術(shù)組僅把栓線插入ICA 6 mm而不入顱，術(shù)后不給予任何處理。

1.2.3 用藥方法 西藥組灌胃給予吡拉西坦片(南利民制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)，每片0.4 g，產(chǎn)品批號：0612146)，按50 mg/100 g大鼠/每日計(jì)算；中藥低劑量組、中藥高劑量組灌胃給予滋腎通絡(luò)方(由制首烏、白芍、生山楂、紅花按15∶12∶12∶5比例組成)水溶液2 ml(中藥低劑量組1 ml≈1.28 g生藥，中藥高劑量組1 ml≈2.55 g生藥)，按成人千克體重劑量的6倍、12倍給予；余二組分別灌胃給予生理鹽水2 ml，每天1次，共20天。于造模成功后24小時給藥，固體飼料和水自由攝取。

1.3 免疫組織化學(xué)染色及圖像分析

1.3.1 制片 上述MCAO模型大鼠灌胃20天后，麻醉后迅速斷頭，在低溫下取腦，將左側(cè)海馬部分腦組織迅速切成1.8 mm厚的冠狀腦片，置10%福爾馬林液固定，常規(guī)梯度酒精脫水后，石蠟包埋后進(jìn)行連續(xù)切片，切片厚度約4 μm。

1.3.2 染色進(jìn)行免疫組化染色 蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘；3% H2O2去離子水孵育5～10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性；滴加山羊血清工作液室溫孵育10～15分鐘，傾去，勿洗；再滴加適當(dāng)比例稀釋的BDNF抗體，37℃孵育2～3小時或4℃過夜。PBS沖洗3次，每次3分鐘；滴加生物素化二抗工作液，室溫或37℃孵育10～15分鐘；PBS沖洗3次，每次3分鐘；再滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫或37℃孵育10～15分鐘；PBS沖洗3次，每次3分鐘；DAB顯色劑顯色；自來水充分沖洗后用封片劑封片。

1.3.3 檢測方法 首先光鏡下觀察神經(jīng)元出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞。再在高倍鏡(×400倍)下每張切片隨機(jī)選取5個不重疊的區(qū)域進(jìn)行拍攝，將圖像輸入到HPIAS-1000高清晰彩色病理圖文分析系統(tǒng)內(nèi)，在相同的背底倍體條件下選擇相應(yīng)的參數(shù)進(jìn)行計(jì)算機(jī)完全定量分析，用平均灰度值來表述BDNF的蛋白含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

各組腦組織BDNF蛋白表達(dá)的比較見圖1～5及表1。由圖1可見，假手術(shù)組海馬區(qū)BDNF切片染色很弱，幾乎無陽性細(xì)胞表達(dá)；圖2可見，切片染色增強(qiáng)，陽性細(xì)胞略有表達(dá)；圖3、圖4、圖5可見，西藥組、中藥低劑量組及中藥高劑量組均見到切片染色強(qiáng)，BDNF陽性細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)，尤以中藥高劑量組陽性細(xì)胞表達(dá)最強(qiáng)。 由表1可看出， 模型組大鼠局灶性腦缺血后， 腦組織BDNF平均灰度值升高，但與假手術(shù)組比較無顯著性差異(P>0.05)；西藥組、中藥高劑量組、中藥低劑量組腦組織BDNF平均灰度值較假手術(shù)組及模型組顯著升高(P值均小于0.01)。中藥高劑量組平均灰度值較中藥低劑量組及西藥組明顯升高(P<0.05)。

圖1 假手術(shù)組海馬區(qū)BDNF的表達(dá)

圖2 模型組海馬區(qū)BDNF的表達(dá)

圖3 西藥組海馬區(qū)BDNF的表達(dá)

圖4 中藥低劑量組海馬區(qū)BDNF的表達(dá)

圖5 中藥高劑量組海馬區(qū)BDNF的表達(dá)

組別平均灰度值假手術(shù)組113.42±23.23模型組118.64±16.27西藥組134.46±18.56ab中藥低劑量組135.32±16.42ab中藥高劑量組144.74±15.31abcd

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01；與西藥組比較，cP<0.05；與中藥低劑量組比較，dP<0.05

3 討論

腦梗死有病死率高、致殘率高的特點(diǎn)，在腦缺血損傷過程中，神經(jīng)細(xì)胞損害與死亡是導(dǎo)致神經(jīng)功能永久性喪失的重要因素?；诖耍狙芯块_創(chuàng)滋腎通絡(luò)法治療本病，并用免疫組化法揭示實(shí)驗(yàn)性大鼠腦梗死的發(fā)病機(jī)理及滋腎通絡(luò)方對模型動物神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用和神經(jīng)修復(fù)作用的影響。旨在改善臨床腦梗死的防治現(xiàn)狀，并為中醫(yī)藥防治該病提供分子水平的理論依據(jù)。

根據(jù)臨床多年治療缺血性中風(fēng)的經(jīng)驗(yàn)，把滋補(bǔ)腎陰和活血通絡(luò)法結(jié)合起來，提出滋腎通絡(luò)是缺血性中風(fēng)的基本治法，使腎精得復(fù)，腦髓得充，經(jīng)絡(luò)暢通“補(bǔ)而不膩，通而不泄”，腦絡(luò)得以濡養(yǎng)。滋腎通絡(luò)方藥凡4味，由何首烏、白芍、山楂、紅花組成，是筆者多年在臨床觀察應(yīng)用于缺血性卒中治療的經(jīng)驗(yàn)方。本方藥味雖少，但能充分體現(xiàn)滋腎通絡(luò)的治法，其制方遣藥，謹(jǐn)遵君臣佐使方意。

BDNF廣泛存在于腦內(nèi)各組織，以大腦皮質(zhì)、海馬、紋狀體分布最為豐富。BDNF在腦內(nèi)對發(fā)育中的交感、感覺和運(yùn)動神經(jīng)元的存活、分化和增殖有促進(jìn)作用[2-4]，并具有抗凋亡作用[5]。BDNF是唯一不斷的在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)組織中表達(dá)的神經(jīng)營養(yǎng)因子，它能促進(jìn)神經(jīng)元生存、延緩變性的自然死亡，參與腦缺血損傷的保護(hù)過程[6]。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，模型組大鼠局灶性腦缺血20天后BDNF表達(dá)反應(yīng)性增強(qiáng)，說明BDNF與損傷后神經(jīng)元的修復(fù)作用有關(guān)。經(jīng)滋腎通絡(luò)方治療后BDNF表達(dá)顯著增強(qiáng)，特別是中藥高劑量組增強(qiáng)更明顯，與西藥組及模型組比較有顯著性差異(P<0.05)。說明滋腎通絡(luò)方可通過調(diào)節(jié)BDNF的合成，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的存活和損傷修復(fù)，從而減輕缺血性腦損傷。

參考文獻(xiàn)

[1] Longa EZ,WeinsteinPr,Carlson,et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats [J]. Stroke,1989,20(1):84-91

[2] Ying SX,Cheng JS.Effect of electro-acupunture on c-fos expression in gerbil hippcampus during transient global ischemia[J].Acupunct Electrother Res,1994,19(4):207-213.

[3] Barde YA,Edger D,Thoenen H.Puritication of a new neurotro- phicfactor from mammalian brain[J].EMBOJ,1982,1(5):549-553.

[4] Tsukahara T,Yonekawa Y,Tanaka K,et al.The role of brain derived neurotrophic fator in transient forebrain ischemia in the rat brain[J]. Neuro-surgery,1994,34(2):323-331.

[5] Pringle AK,Sundstrom LE,Wild GJ.Brain derived neurotrophic factor,but not neurophin-3,prevents ischemia induced neuronal cell death in orgenotypic rat hippocampus slice cultures[J].Neurosci Lett,1996,211:203-206.

[6] Endres M, Fan G, Hirt L, Fuji M, Matsushita K, Liu X, Jaenisch R, Moskowitz MA.Ischemic brain damage in mice after secretive modifying BDNF or NT-4 gene expression[J].J Cereb Blood Flow Metab,2000,20(1):139-144.