大黃與易混偽品土大黃、虎杖原植物的ITS2序列鑒定

李美妮 韓蕊蓮 韓建萍 姚輝 羅焜 宋經(jīng)元

大黃Radix et Rhizoma Rhei為蓼科植物掌葉大黃RheumpalmatumL．、唐古特大黃RheumtanguticumMaxim．ex Balf．或藥用大黃RheumofficinaleBaill．的干燥根及根莖[1]。掌葉大黃及唐古特大黃商品習稱西大黃；藥用大黃商品習稱雅黃、南大黃。大黃具有瀉腸通便、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)的功效。大黃為常用中藥，用量較大，當藥源供不應求時，有些地方用土大黃代替大黃使用[2]，這就影響了大黃準確、安全的臨床效用。土大黃為蓼科植物鈍葉酸模RumexobtusifoliusL.、羊蹄RumexjaponicusHoutt.、尼泊爾酸模RumexnepalensisSpreng、網(wǎng)果酸模RumexchalepensisMill.和巴天酸模RumexpatientisL.的根及根莖[3]。土大黃具有止血、清熱解毒和消腫的功效。以往的研究已經(jīng)從來源、性狀、顯微、理化、功能及主治等幾方面對大黃和土大黃進行了鑒別[4]。另外，《中國藥典》記載的藥材虎杖的原植物蓼科植物虎杖PolygonumcuspidatumSieb. et Zucc.與大黃也常常容易被混淆?；⒄染哂徐铒L利濕、散瘀定痛、祛痰的功效。

植物DNA條形碼就是利用一個或少數(shù)幾個標準的DNA片段快速、準確識別和鑒定植物種類[5],已成為近年來生物分類學研究的熱點之一和物種鑒定的一種有力工具。自陳士林等和Yao等[6，7]提出ITS2序列可以作為藥用植物乃至植物潛在的候選條形碼以來，對于不同科屬如薔薇科、大戟科、菊科、豆科、蕓香科、景天屬、黃芪屬、重樓屬、豆蔻屬[8-16]，該序列均能成功鑒定相關近緣物種，而且在中藥及其混偽品鑒定中顯示了極大的應用前景，如筋骨草、砂仁、金錢草、京大戟、黨參、藁本、小茴香、威靈仙、大青葉、赤芍、高良姜、垂盆草[13，17-27]。ITS2序列短，一般為200 bp左右，容易被成功擴增和測序，甚至對一些降解的藥材及粉末也能進行分析。實驗研究所需材料少，結果不受環(huán)境因素及物種發(fā)育階段的影響，對于形態(tài)學上難鑒定的密切相關種具有鑒定準確的優(yōu)勢。宋經(jīng)元等[28]已經(jīng)用trnH-psbA序列成功區(qū)分開了包括大黃、虎杖在內(nèi)的蓼科18個物種，本文擬用已經(jīng)被廣泛使用的ITS2序列對中藥大黃與其混偽品土大黃、虎杖原植物進行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料來源

材料來源如表1所示，由中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所林余霖副研究員鑒定。其中有標本號的為實驗材料的序列，實驗原材料為硅膠干燥的葉片。其余序列信息下載自GenBank，下載時間為2011年9月。

1.2 方法

提取DNA、PCR和測序：參見前人研究[6]。

數(shù)據(jù)分析：拼接序列去除引物序列，然后去除5.8S和26S編碼區(qū)得到ITS2序列，最后計算K2P遺傳距離并基于此建立系統(tǒng)發(fā)生樹[27]。

表1 材料來源

2 結果

2.1 大黃種內(nèi)序列比對分析

由于中藥大黃屬于多基原藥材，所以分析時不僅考慮了各個基原內(nèi)的種內(nèi)序列比對，還有基原間的種間序列比對。除了藥用大黃種內(nèi)序列有1個堿基插入缺失外，供試掌葉大黃和唐古特大黃的種內(nèi)序列均完全相同。大黃種內(nèi)比對長度為187 bp，有14個堿基變異。見圖1。

2.2 大黃與其混偽品土大黃、虎杖的種間序列比對分析

將土大黃的三個基原植物作為一個整體，與大黃的三個基原整體序列進行比對，比對后序列長度為218 bp,有83個堿基的變異，另有41個堿基插入或缺失?；⒄扰c大黃的三個基原整體比對后序列長度為201 bp,有61個堿基變異，另有17個堿基插入或缺失。如圖1所示。

2.3 大黃與其混偽品土大黃、虎杖的K2P遺傳距離分析

大黃的三個基原種內(nèi)、種間的K2P距離，大黃的三個基原分別與土大黃的三個基原、虎杖間的K2P距離如表2所示。根據(jù)表2計算大黃的種內(nèi)K2P距離，與土大黃、虎杖的種間K2P距離，結果見表3。種間最小K2P距離(38.6%)大于種內(nèi)最大K2P距離(8.0%)，因此ITS2序列能夠識別大黃原植物及其混偽品土大黃和虎杖。

圖1 大黃、土大黃、虎杖種內(nèi)種間ITS2序列比對

Rh．officinaleRh．palmatumRh．tanguticumRh．officinale0Rh．palmatum1．10Rh．tanguticum6．88．00Ru．japonicus45．544．547．6Ru．nepalensis47．546．748．7Ru．obtusifolius47．146．449．4Polygonumcuspidatum39．939．638．6

表3 大黃及其混偽品的種內(nèi)種間K2P距離統(tǒng)計

2.4 聚類分析

從系統(tǒng)聚類樹中，可以看出中藥大黃的三個基原植物聚為一支，支持率為100，基于ITS2序列的K2P模型系統(tǒng)聚類樹能夠將大黃與土大黃、虎杖成功地區(qū)分開。中藥土大黃三個基原植物聚為一支，支持率為99，土大黃能夠與虎杖相區(qū)別?；诰垲惙治霰砻鳎琁TS2序列可以準確區(qū)分大黃原植物及其混偽品土大黃和虎杖。見圖2。

3 討論

本文分析了大黃、土大黃、虎杖基原植物編碼核糖體RNA的核基因的ITS2序列的K2P距離，并基于K2P距離建立了系統(tǒng)進化樹，均證明ITS2序列可以準確鑒定這三種藥材及不同基原植物，為大黃及其混偽品的鑒別提供了新的分子水平的研究方法。雖然對于土大黃3個基原沒有完全區(qū)別開，但條形碼技術并非只局限于單個物種，如一群聚集的個體、一群界限不明的物種[29]，因此本文將土大黃作為一個整體的研究思路是可以接受的。另外從系統(tǒng)進化樹可以看出土大黃的其中三個基原植物先聚在一起成為一支后，支持率為99，再與虎杖聚為一大支，說明土大黃與虎杖的親緣關系較大黃近，這與臨床應用上虎杖和土大黃經(jīng)?；煜默F(xiàn)象一致。從系統(tǒng)發(fā)生樹又可以看出藥用大黃的4個不同樣品來源先與掌葉大黃的2個不同樣品來源聚為一支，支持率為91，然后再與唐古特大黃聚為一支，即藥用大黃與掌葉大黃的親緣關系較唐古特大黃更近。這與索風梅等[30]通過分析大黃三個基原AFLP，研究其親緣關系的結果一致。從而更進一步說明植物DNA條形碼技術為中藥鑒定提供了有力的依據(jù)，也對植物系統(tǒng)分類工作起到了輔助作用。值得提醒的是，提取大黃DNA時應特別關注真菌污染，尤其是根部?？梢酝ㄟ^BLAST方法對所獲序列進行比對查錯，保證后續(xù)的分析結果的準確性。

中藥是一個復雜化學物質(zhì)體系，發(fā)揮療效通過多成分、多層次、多靶點和多途徑作用于人體，所以難以從某1～2種成分對其進行鑒定，反應藥品的內(nèi)在質(zhì)量。因此，在結合傳統(tǒng)的形狀鑒定、顯微鑒定和理化鑒定等傳統(tǒng)鑒定方法的基礎上，能夠成功利用一些現(xiàn)代化分析技術例如近幾年的研究熱點技術——DNA條形碼技術鑒別中藥真?zhèn)?，這一結論無疑給中藥鑒定工作帶來了極大的促進和希望。

圖2 基于K2P模型的ITS2序列的NJ系統(tǒng)發(fā)生樹圖(bootstrap 1000次重復，枝上數(shù)值僅顯示自展支持率≥50%)

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