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    腸胃清煎劑對裸鼠大腸癌皮下移植瘤奧沙利鉑治療的增效作用

    2012-05-17 07:09:02金泉克許建華肖海娟陸海余文燕王國娟孫玨范忠澤
    環(huán)球中醫(yī)藥 2012年3期
    關(guān)鍵詞:煎劑腸胃皮下

    金泉克 許建華 肖海娟 陸海 余文燕 王國娟 孫玨 范忠澤

    大腸癌是世界各國惡性腫瘤中的主要死亡原因之一,在中國,大腸癌的死亡率位居癌癥死亡率的第4、5位[1],而發(fā)達地區(qū)其死亡率已上升到各種惡性腫瘤中的第3位,上海則已居第二位[2]。奧沙利鉑是目前結(jié)腸癌的一線化療用藥,雖然奧沙利鉑對許多耐順鉑或卡鉑的腫瘤細胞仍抑制作用,并且在抗癌活性及毒副反應(yīng)方面表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢,但奧沙利鉑耐藥問題也成為影響臨床療效的一大難題[3]。筆者的前期研究表明,具有健脾化濕解毒功效的上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院制劑腸胃清方可明顯提高晚期胃腸道腫瘤患者以鉑類為基礎(chǔ)的化療的療效,明顯改善生存質(zhì)量,延長中位生存期[4,5]。應(yīng)用筆者所在的課題組建立的奧結(jié)腸癌耐藥細胞株HCT 116/L-OHP及其親本株HCT 116進行實驗,體外實驗研究表明,腸胃清藥物血清可通過影響DNA損傷修復(fù)途徑,提高奧沙利鉑抑制腫瘤細胞增殖的效果[6]。本研究在上述工作的基礎(chǔ)上,建立HCT 116及HCT 116/L-OHP結(jié)腸癌皮下移植瘤模型,進一步觀察中藥復(fù)方腸胃清煎劑對L-OHP抑瘤的增效作用。

    1 材料與方法

    1.1 細胞系及實驗動物

    人結(jié)腸癌細胞株HCT 116,購于南京凱基生物公司。HCT 116/L-OHP為本實驗室自行誘導(dǎo),對L-OHP耐藥倍數(shù)達17.00倍。BALB/c裸小鼠80只,4~6周齡,體重(20±2)g,雌雄各半。購自于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司[生產(chǎn)許可證號為SCXK (滬) 2003-0002],飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院動物房SPF級動物實驗室[動物實驗室許可證號為SYXK (滬) 2005-0008],自由飲食。

    1.2 主要試劑及儀器

    CELL 240型二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(德國賀利氏公司);倒置顯微鏡(日本Olympus公司);101-2干燥箱(上海市實驗儀器總廠);95%乙醇(分析純)(上海振興化工廠);奧沙利鉑(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司);乙二醇雙乙胺醚-N,N’-四乙酸(EDTA)(Sigma公司)。

    1.3 中藥制備

    腸胃清煎劑:由生黃芪30 g、黨參15 g、生白術(shù)15 g、豬苓24 g、薏苡仁30 g、八月札24 g、野葡萄藤30 g、紅藤30 g組成。由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院制劑室熬制成水煎劑,參照人與小鼠等效劑量換算公式,小鼠劑量約合25 g/kg,高劑量組為50 g/kg。煎煮方法:加水浸泡1小時,水煎2次,每次煎煮1.5小時,每次用水量為藥材的10倍量,水煎液過濾后濃縮至約150 ml,即為含生藥1.33 g/ml的水煎劑。

    1.4 人結(jié)腸癌耐藥細胞株HCT 116/L-OHP的皮下移植瘤的建立

    接種方法參考《細胞培養(yǎng)》[7],取對數(shù)生長期HCT 116/L-OHP及HCT 116。將細胞消化后收集到離心管中,然后用磷酸緩沖液(PBS)制成濃度為1×107/ml的細胞懸液。取4~6周齡BALB/C裸鼠6只,體重(20±2)g,雌雄各半。常規(guī)消毒裸鼠右前肢的腋部皮下。按2×106個/0.2 ml的細胞數(shù)量,接種到裸小鼠的右前肢的腋部皮下,傳代14天后,自裸鼠身上剝離腫瘤組織,選取生長狀態(tài)良好,無破潰的腫瘤組織置于生理鹽水中,切成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊備用。在超凈臺中,裸鼠常規(guī)消毒,用20號套管針接種于裸小鼠背部右側(cè)近前肢皮下。本實驗所用腫瘤細胞株為第4代,異位瘤傳至第3代為模型。

    1.5 L-OHP劑量的確定

    最大耐受劑量(maximum tolerated dose,MTD)指動物能夠耐受的而不引起動物死亡的最高劑量。通過預(yù)實驗,確認(rèn)本研究以裸小鼠對L-OHP 1/2 MTD為實驗劑量。參照文獻[8]報道,選擇健康裸小鼠15只,分設(shè)不同的劑量組(30、25、20、15、10 mg/kg),每組3只動物,每周腹腔注射L-OHP 3次(星期一、三、五),連續(xù)3周,最后確定本研究的MTD,1/2 MTD作為實驗劑量。實驗結(jié)果僅有10 mg/kg組裸鼠均存活,即本研究MTD量。故以5 mg/kg作為實驗劑量。見表1。

    表1 荷瘤裸鼠L-OHP劑量確定

    1.6 動物分組及藥物干預(yù)

    參照《中藥新藥研制開發(fā)技術(shù)與方法》[9]。造模成功后,待HCT 116及HCT 116/L-OPH腫瘤生長至50~100 mm3左右,分別將50只裸鼠隨機分成5組,每組10只:對照組予以生理鹽水灌胃,0.4 ml/次,1天1次,每周5次,并予以生理鹽水腹腔注射,隔天1次,每周3次,共3周;腸胃清組,以50 g/kg的腸胃清煎劑予以灌胃,0.4 ml/次,1天1次,每周5次,并予以生理鹽水腹腔注射,同前,共3周;L-OPH組予以1/2 MTD L-OPH腹腔注射,隔天1次,每周3次,共3周,生理鹽水灌胃同前;腸胃清高、低劑量+L-OPH組,分別按50 g/kg和25 g/kg的腸胃清煎劑予以灌胃,0.4 ml/次,1天1次,每周5次,予以L-OPH 1/2 MTD腹腔注射,隔天1次,每周3次,共3周。

    1.7 腫瘤體積的測量

    以腫瘤體積的變化,反映藥物的療效。從開始給藥當(dāng)天即用卡尺測量腫瘤大小,每周2次,腫瘤體積以公式〔π/6(w1×w2×w2)〕計算(w1為瘤塊最大徑,w2為最小徑),根據(jù)測定結(jié)果描繪腫瘤生長曲線。并以此計算T/C%(T代表實驗組腫瘤體積,C代表對照組腫瘤體積)[10]。

    1.8 荷瘤小鼠的體重

    以體重的減輕反映治療的毒副作用。體重每周測定3次,直至末次治療后2周。體重的減輕用公式:開始體重-最輕體重/開始體重×100%計算[11]。

    1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

    2 結(jié)果

    2.1 腸胃清煎劑聯(lián)合化療藥物對皮下移植瘤瘤體抑制率

    瘤體生長曲線表明,腸胃清煎劑及L-OHP均能在一定程度延緩皮下移植瘤的生長,腸胃清聯(lián)合化療藥物可顯著減緩腫瘤的生長,尤以腸胃清高劑量+L-OHP組瘤體生長最為緩慢,見圖1、3。腸胃清組、L-OHP組、腸胃清高、低劑量+L-OHP組對荷HCT 116移植瘤小鼠抑瘤率分別為84.48%、56.66%、53.75%、48.32%,以腸胃清煎劑聯(lián)合L-OHP組明顯,與對照組有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01);對荷HCT 116/L-OHP移植瘤小鼠抑瘤率分別為74.87%、47.90%、43.52%、38.01%,與對照組有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01);見圖2、4。同時聯(lián)合給藥對耐藥株皮下異位瘤的抑制率較敏感株增加,其抑制效果明顯,在有效治療劑量中,與腸胃清劑量存在量效關(guān)系,見圖1-4。

    2.2 腸胃清煎劑聯(lián)合化療藥物對皮下移植瘤荷瘤體重的影響

    圖1 腸胃清煎劑對HCT 116/L-OHP細胞系皮下移植瘤瘤體生長曲線

    圖2 腸胃清煎劑對HCT116/L-OHP細胞系皮下移植瘤抑瘤率

    圖3 腸胃清煎劑對HCT116細胞系皮下移植瘤瘤體生長曲線

    圖4 腸胃清煎劑對HCT116細胞系皮下移植瘤抑瘤率

    兩組移植瘤小鼠體重在治療后,敏感株異位瘤組:對照組體重減輕為2%,腸胃清組、L-OHP組、腸胃清高、低劑量+L-OPH組裸鼠體重減輕分別為5%、9.87%、7%、6.43%,同空白對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),見表2;耐藥細胞株異位瘤組:對照組體重減輕為2.20%,腸胃清組、L-OHP組、腸胃清高、低劑量+L-OPH組裸鼠體重減輕分別為4.29%、8.77%、3.21%、3.97%,以L-OHP組最為顯著,同空白對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),兩腸胃清煎劑聯(lián)合化療作用組荷瘤鼠體重減輕影響均少與化療組,同對照組比較沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05);同L-OHP組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。見表3。

    表2 腸胃清煎劑對荷HCT116移植瘤小鼠體重變化

    注:與對照組相比aP<0.05。

    表3 腸胃清煎劑對荷HCT116/L-OHP移植瘤小鼠體重變化

    注:與對照組相比aP<0.05,同L-OHP組比較bP<0.05。

    3 討論

    近年來中國結(jié)腸癌發(fā)病率逐漸升高,但臨床上腫瘤化療耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重,影響了患者生存期的延長和生活質(zhì)量的改善[12]。腫瘤的多藥耐藥性(MDR)是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程,影響因素和參與機制眾多,這也是造成化療失敗的重要原因[13]。臨床和實驗研究表明,中醫(yī)藥聯(lián)合化療可提高化療的效果,其增效作用不僅表現(xiàn)在非鉑類化療的個體中,而且在以鉑類為基礎(chǔ)治療方案的肺癌、卵巢癌等腫瘤中也得到充分體現(xiàn)[14,15]。體內(nèi)的增效作用,與增加腫瘤化療的敏感性密切相關(guān),同時與減少腫瘤血管的生成、抑制癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移、調(diào)節(jié)機體的免疫功能等關(guān)聯(lián)。

    大腸癌在中醫(yī)學(xué)中屬“積聚”、“腸風(fēng)”、“下痢”、“臟毒”等范疇,其發(fā)病普遍認(rèn)為涉及二方面因素:一為內(nèi)因,為正氣不足;一是外因,為毒邪損傷腸絡(luò),痰瘀凝聚腸道所致。腸胃清方是上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院博士生導(dǎo)師范忠澤教授的經(jīng)驗方,主要由生黃芪、白術(shù)、豬苓、米仁、八月札、野葡萄藤等組成,具有益氣補脾、燥濕理氣解毒之功效。對病理確診的術(shù)后復(fù)發(fā)或未能手術(shù)的晚期胃癌、大腸癌患者,在化療方案的基礎(chǔ)上,加用具有健脾化濕解毒作用的中藥復(fù)方,與單純化療組對比,中藥復(fù)方加化療組生存質(zhì)量明顯提高,中位生存期明顯延長[4,5]。

    奧沙利鉑(L-OHP)是近年來被推薦的II、III期結(jié)直腸癌的一線治療藥物,是繼順鉑、卡鉑后推出的第三代鉑類抗癌藥,其特點是對耐順鉑、卡鉑細胞株均有顯著的抑制作用[16]。本實驗通過逐步增加作用于親代細胞HCT 116的L-OHP濃度與間斷大劑量L-OHP作用,建立耐藥細胞HCT 116/L-OHP[17],采用皮下接種的方式建立結(jié)腸癌皮下異位瘤模型,觀察了腸胃清煎劑對L-OHP治療結(jié)腸癌耐藥細胞皮下移植瘤的增效作用。研究結(jié)果顯示,腸胃清煎劑聯(lián)合L-OHP組荷瘤小鼠體重減輕影響均少于化療組,尤其是對HCT 116/L-OHP耐藥細胞異位瘤裸鼠體重的減輕影響效果更為顯著,表明腸胃清煎劑可以減少L-OHP的毒副作用。同樣,腸胃清煎劑具有一定抑制腫瘤生長的能力,在聯(lián)合化療藥物作用下,其抑制效果明顯,以耐藥細胞異位瘤體更為顯著,表明腸胃清煎劑可以對L-OHP治療耐藥結(jié)腸癌具有增敏作用。而且,在有效治療劑量中,與腸胃清煎劑劑量存在量效關(guān)系。

    隨著對腫瘤多藥耐藥機制研究的深入,逆轉(zhuǎn)耐藥治療已成為腫瘤治療的熱點之一,而耐藥機制的復(fù)雜性決定了理想的逆轉(zhuǎn)藥物應(yīng)該具有多靶點效應(yīng)。中藥復(fù)發(fā)的多靶點特性,在腫瘤治療中的作用引起了人們的廣泛關(guān)注,臨床實踐證明腸胃清煎劑具有良好的減毒增效作用,且體外研究已表明中藥逆轉(zhuǎn)耐藥的有效性。本研究亦表明,化療藥物聯(lián)合腸胃清煎劑后,其抑制裸鼠體內(nèi)耐藥皮下移植瘤的作用明顯得到增強,其增效作用與增加瘤體內(nèi)的藥物濃度有關(guān),但其具體的作用機制目前尚不明確,有待進一步的研究。

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