ATDC在胃癌中的表達(dá)及其與幽門螺桿菌感染的關(guān)系

汪偉民* 蔡煒龍 潘 杰 許洪寶

浙江省湖州市中心醫(yī)院普外科（313000）

胃癌為最常見的惡性腫瘤之一，根據(jù)全球癌癥統(tǒng)計(jì)資料，2008年胃癌新發(fā)病例數(shù)和死亡病例數(shù)分別占癌癥總體新發(fā)病例數(shù)和死亡病例數(shù)的8%和10%，70%以上的新發(fā)病例和死亡病例出現(xiàn)于發(fā)展中國家[1]。胃癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多因素參與的多步驟過程，幽門螺桿菌（H.pylori）感染與胃癌發(fā)生密切相關(guān)目前已成為共識[2]。ATDC基因（ataxia-telangiectasia group D complementing gene）又名 TRIM29（tripartite motif-containing 29），定位于染色體11q22-23，編碼由588個氨基酸構(gòu)成的蛋白質(zhì)。ATDC蛋白的氨基酸序列中含有多個鋅指基序和一個亮氨酸拉鏈基序，使之可形成同源或異源二聚體。ATDC在正常成體組織中表達(dá)于胎盤、前列腺和胸腺，在胚胎組織中表達(dá)于外胚層[3]，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制電離輻射敏感性的功能。Kosaka等[4]的研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中ATDC表達(dá)較正常胃黏膜顯著增高，其高表達(dá)可作為胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的標(biāo)記。關(guān)于胃癌組織中ATDC表達(dá)與H.pylori感染的關(guān)系，目前尚未見文獻(xiàn)報道。本研究通過檢測胃癌組織中的ATDC表達(dá)并分析其表達(dá)與胃癌臨床病理特征和患者H.pylori感染狀態(tài)的關(guān)系，旨在進(jìn)一步明確ATDC在胃癌中的作用，并初步探討ATDC與H.pylori相關(guān)胃癌的關(guān)系，以期為胃癌的有效防治提供新的思路。

材料與方法

一、標(biāo)本獲取

選取2008年6月～2010年5月于浙江省湖州市中心醫(yī)院行胃癌根治術(shù)的72例胃癌患者的癌組織和相應(yīng)癌旁非癌組織（距胃灶邊緣3～5 cm）石蠟包埋標(biāo)本，所有標(biāo)本均經(jīng)HE染色病理檢查明確診斷，按美國癌癥聯(lián)合會（AJCC）標(biāo)準(zhǔn)對胃癌行組織學(xué)分級。入選患者男38例，女34例，年齡32～76歲，平均（54.6±16.6）歲。所有患者均未接受過H.pylori根除治療，術(shù)前未接受過放化療。經(jīng)13C-尿素呼氣試驗(yàn)（13C-UBT）判定 H.pylori感染情況，H.pylori陰性28例，陽性44例，陽性率為61.1%。

二、ATDC免疫組化染色

以免疫組化SP法檢測胃癌組織和相應(yīng)癌旁組織中的ATDC表達(dá)和分布。兔抗人TRIM29多克隆抗體為Abcam plc.產(chǎn)品，即用型兔SP免疫組化檢測試劑盒（含生物素標(biāo)記羊抗兔IgG和HRP標(biāo)記鏈霉卵白素工作液）為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。以PBS代替一抗作為陰性對照，以已知ATDC染色陽性切片作為陽性對照。

結(jié)果判定：ATDC免疫反應(yīng)陽性物質(zhì)定位于細(xì)胞質(zhì)。隨機(jī)選取10個200倍視野，每視野計(jì)數(shù)400個細(xì)胞。陽性細(xì)胞比例：無，0分；<30%，1分；30%～60%，2分；≥60%，3分。陽性染色強(qiáng)度：無，0分；弱，1分；一般，2分；強(qiáng)，3分。總分為兩組分值之和：0 分，陰性（－）；1～2 分，弱陽性（±）；3～4 分，陽性（+）；5～6 分，強(qiáng)陽性（++）。 陽性和強(qiáng)陽性判定為ATDC表達(dá)陽性。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)，組間等級資料的比較采用Wilcoxon檢驗(yàn)或Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、胃癌和相應(yīng)癌旁組織ATDC表達(dá)比較

72例胃癌組織中，ATDC陰性、弱陽性、陽性、強(qiáng)陽性表達(dá)例數(shù)分別為5、12、40、15例，陽性表達(dá)率為76.4%（55/72），其表達(dá)定位于腫瘤細(xì)胞質(zhì)；相應(yīng)癌旁組織ATDC陰性、弱陽性、陽性、強(qiáng)陽性表達(dá)例數(shù)分別為 50、20、2、0例， 陽性表達(dá)率為 2.8%（2/72），其表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)（見圖1）。胃癌組織ATDC陽性表達(dá)率明顯高于相應(yīng)癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

二、ATDC表達(dá)與胃癌臨床病理特征和患者H.pylori感染狀態(tài)的關(guān)系

圖1 ATDC在胃癌和相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)（免疫組化SP法，×200）

中低分化、伴轉(zhuǎn)移（包括淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移）、伴H.pylori感染的胃癌患者，胃癌組織ATDC陽性表達(dá)率和表達(dá)強(qiáng)度分別明顯高于高分化、不伴轉(zhuǎn)移、不伴 H.pylori感染的胃癌患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；不同性別組間ATDC表達(dá)則無明顯差異（見表1）。表明ATDC表達(dá)與胃癌組織學(xué)分級、轉(zhuǎn)移以及患者的H.pylori感染狀態(tài)相關(guān)，而與患者性別無關(guān)。

表1 ATDC表達(dá)與胃癌臨床病理特征和患者H.pylori感染狀態(tài)的關(guān)系

討 論

胃癌是嚴(yán)重威脅人類健康的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其早期診斷和治療一直是相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。已知H.pylori是人類胃癌的Ⅰ類致癌原，因此尋找H.pylori相關(guān)胃癌的分子標(biāo)記物對胃癌的有效防治具有重要意義。

ATDC又名TRIM29，屬于TRIM蛋白家族，其特征性結(jié)構(gòu)為含有三個鋅結(jié)合域（R、B1、B2）和一個卷曲螺旋區(qū)域（CC），ATDC 含有 B1、B2和 CC。TRIM蛋白家族為RING型E3泛素連接酶亞家族之一，其成員參與了發(fā)育、細(xì)胞生長等多種生物學(xué)過程以及一些人類疾病如HIV感染和惡性腫瘤的發(fā)生。研究顯示ATDC在肺癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、多發(fā)性骨髓瘤、胃癌、胰腺癌中呈高表達(dá)，在黑素瘤、乳腺癌、頭頸部癌、前列腺癌中呈低表達(dá)[3～6]。

Kosaka等[4]以實(shí)時RT-PCR和免疫組化技術(shù)檢測了124例胃癌患者的ATDC mRNA和蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)胃癌組織中的ATDC mRNA表達(dá)水平是相應(yīng)非癌組織的3.07倍，胃癌組織中ATDC陽性染色定位于腫瘤細(xì)胞質(zhì)，基質(zhì)細(xì)胞和正常上皮細(xì)胞中未見ATDC表達(dá)；ATDC mRNA表達(dá)與胃癌的大小、組織學(xué)分級、浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)；多變量logistic回歸模型顯示ATDC mRNA高表達(dá)可作為胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立預(yù)測因素；此外，ATDC mRNA高表達(dá)尚與預(yù)后不良相關(guān)。Wang等[6]的研究顯示，ATDC在正常胰腺組織和慢性胰腺炎組織中基本不表達(dá)，在絕大多數(shù)侵襲性胰腺癌以及胰腺癌前病變中呈高表達(dá)，具有加速癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用。

本研究以免疫組化方法檢測ATDC在胃癌組織和相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ATDC在胃癌組織中的陽性表達(dá)率顯著高于相應(yīng)癌旁組織（76.4%對2.8%），且胃癌組織中的ATDC表達(dá)與胃癌組織學(xué)分級和轉(zhuǎn)移相關(guān)，表明ATDC可能參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展。

Wnt/β-catenin信號通路為常見腫瘤信號通路，大量研究[7～10]顯示該信號通路障礙為胃癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制之一。關(guān)于胰腺腫瘤中ATDC表達(dá)的研究[6]顯示，胰腺癌組織中的ATDC表達(dá)與β-catenin水平升高相關(guān)，進(jìn)一步探討其機(jī)制，發(fā)現(xiàn)ATDC可與 Dvl-2蛋白（Wnt/β-catenin信號通路 Axin/Gsk-3β/APC降解復(fù)合體中Gsk-3β的負(fù)調(diào)控因子）結(jié)合并穩(wěn)定其表達(dá)，從而使β-catenin從降解復(fù)合體中釋放以穩(wěn)定其表達(dá)，進(jìn)而激活下游由β-catenin/TCF/LEF調(diào)節(jié)的靶基因轉(zhuǎn)錄，表明ATDC系通過激活Wnt/β-catenin信號通路發(fā)揮致胰腺癌作用。關(guān)于卵巢癌組織中ATDC與β-catenin關(guān)系的研究[11]亦表明β-catenin可能是ATDC參與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的效應(yīng)蛋白。由此推測ATDC在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用亦可能是通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路實(shí)現(xiàn)的，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

此外，有研究[12]發(fā)現(xiàn)ATDC可與乙酰轉(zhuǎn)移酶蛋白Tip60結(jié)合，ATDC過表達(dá)促進(jìn)Tip60降解并改變其細(xì)胞內(nèi)分布，使Tip60對p53的乙?；饔媒档停瑢?dǎo)致細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)化活性增強(qiáng)。另有研究[13]發(fā)現(xiàn)，ATDC可通過與p53結(jié)合阻止其進(jìn)入細(xì)胞核，從而抑制p53的核活性以及由p53調(diào)節(jié)的基因如p21、NOXA表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖。上述機(jī)制可用于解釋ATDC對腫瘤細(xì)胞的促增殖作用。因此ATDC參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展還可能與p53信號通路有關(guān)。

本研究還發(fā)現(xiàn)伴H.pylori感染的胃癌患者胃癌組織ATDC陽性表達(dá)率和表達(dá)強(qiáng)度顯著高于不伴H.pylori感染的胃癌患者。本組胃癌患者系以13C-UBT判定H.pylori感染情況。鑒于胃癌患者的胃內(nèi)環(huán)境已不適合 H.pylori生存，13C-UBT并不能準(zhǔn)確反映胃癌患者的H.pylori感染狀態(tài)，因此根據(jù)上述結(jié)果僅能推測ATDC與H.pylori相關(guān)胃癌之間可能存在一定聯(lián)系。至于ATDC是否參與了H.pylori相關(guān)胃癌的發(fā)生機(jī)制，抑或ATDC與H.pylori系通過不同機(jī)制，在胃癌發(fā)生、發(fā)展的不同階段起不同作用，以及兩者是否具有協(xié)同致癌作用，均有待進(jìn)一步研究。H.pylori感染可激活胃上皮細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB，NF-κB信號通路在H.pylori相關(guān)胃黏膜炎癥中起關(guān)鍵作用[14,15]，亦為胃癌發(fā)生的重要路徑之一[10]。ATDC參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展是否與NF-κB信號通路有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，ATDC在胃癌組織中的表達(dá)顯著高于相應(yīng)癌旁組織，并與胃癌組織學(xué)分級和轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示其可能參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展；而伴H.pylori感染的胃癌患者胃癌組織ATDC表達(dá)顯著高于不伴 H.pylori感染的胃癌患者，則提示ATDC可能與H.pylori相關(guān)胃癌有一定聯(lián)系。因此，ATDC有望成為新的胃癌分子標(biāo)記物，為胃癌的早期診斷、預(yù)后判斷和基因治療研究提供新的靶點(diǎn)。

1 Jemal A,Bray F,Center MM,et al.Global cancer statistics.CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90.

2 Malfertheiner P,Megraud F,O’Morain C,et al.Current concepts in themanagement ofHelicobacter pylori infection:the MaastrichtⅢ Consensus Report.Gut,2007,56(6):772-781.

3 Reymond A,Meroni G,Fantozzi A,et al.The tripartite motif family identifies cell compartments.EMBO J,2001,20(9):2140-2151.

4 Kosaka Y,Inoue H,Ohmachi T,et al.Tripartite motifcontaining 29 (TRIM29)is a novel marker for lymph node metastasis in gastric cancer.Ann Surg Oncol,2007,14(9):2543-2549.

5 Hatakeyama S.TRIM proteins and cancer.Nat Rev Cancer,2011,11(11):792-804.

6 Wang L,Heidt DG,Lee CJ,et al.Oncogenic function of ATDC in pancreatic cancerthrough Wntpathway activation and beta-catenin stabilization.Cancer Cell,2009,15(3):207-219.

7 Park WS,Oh RR,Park JY,et al.Frequent somatic mutations of the beta-catenin gene in intestinal-type gastric cancer.Cancer Res,1999,59(17):4257-4260.

8 Pan KF,LiuWG,ZhangL,etal.Mutationsin components of the Wnt signaling pathway in gastric cancer.World J Gastroenterol,2008,14(10):1570-1574.

9 Zhang H,Xue Y.Wnt pathway is involved in advanced gastric carcinoma.Hepatogastroenterology,2008,55(84):1126-1130.

10 Ooi CH,Ivanova T,Wu J,et al.Oncogenic pathway combinations predict clinical prognosis in gastric cancer.PLoS Genet 5(10):e1000676.DOI:10.1371/journal.pgen.1000676

11 盛立紅，王輝，楊平.ATDC蛋白在卵巢癌組織中的表達(dá)及其與β-catenin蛋白的關(guān)系.贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2011,31(3):337-339.

12 Sho T,Tsukiyama T,Sato T,et al.TRIM29 negatively regulates p53 via inhibition of Tip60.Biochim Biophys Acta,2011,1813(6):1245-1253.

13 Yuan Z,Villagra A,Peng L,et al.The ATDC(TRIM29)protein binds p53 and antagonizes p53-mediated functions.Mol Cell Biol,2010,30(12):3004-3015.

14 Keates S,Hitti YS,Upton M,et al.Helicobacter pylori infection activates NF-kappa B in gastric epithelial cells.Gastroenterology,1997,113(4):1099-1109.

15 Doger FK,Meteoglu I,Ozkara E,et al.Expression of NF-kappaB in Helicobacter pylori infection.Dig Dis Sci,2006,51(12):2306-2309.