地黃不同種質(zhì)資源產(chǎn)量和指標(biāo)成分HPLC測定比較

李建軍， 王 瑩， 周延清， 李明軍， 李景原

(河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 河南省高校道地中藥材保育及利用工程技術(shù)研究中心 河南 新鄉(xiāng) 453007)

0 引言

地黃(RehmanniagtutinosaLibose)為玄參科多年生草本植物，是常用的補益中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品.主產(chǎn)于河南、河北、山東、山西、內(nèi)蒙古及東北，現(xiàn)全國大部分地區(qū)有栽培.河南懷慶府是地黃的道地產(chǎn)區(qū)，以溫縣、博愛、武陟、孟縣等地產(chǎn)量最大.地黃具有滋陰清熱、補血止血等功效，臨床應(yīng)用極為廣泛.由于采收及炮制加工方法及藥效的差異，地黃藥材分為鮮地、生地和熟地.國內(nèi)外對其化學(xué)成分、藥理作用的研究已有較多的報道[1].

迄今為止，對于地黃的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，尚無很完善的方法.一直以來常用梓醇作為地黃尤其是鮮地和生地的指標(biāo)成分進行品質(zhì)評價.2010年版《中國藥典》把梓醇和毛蕊花糖苷都列為地黃指標(biāo)成分，梓醇作為地黃的主要有效成分之一，具有降血糖、利尿和緩瀉等作用[2-4]；毛蕊花糖苷作為地黃的主要有效成分之一，對神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)具有明顯的作用，特別是針對老年癡呆、慢性腎炎等疾病具有明顯的治療作用[5-7].根據(jù)藥典規(guī)定并參考相關(guān)文獻，作者研究了梓醇和毛蕊花糖苷的HPLC測定方法，進行了方法學(xué)考察，取得了比較滿意的結(jié)果，并對9種主要地黃種質(zhì)資源進行了梓醇和毛蕊花糖苷含量的分析比較,為良種繁育推廣和新品種選育提供相關(guān)數(shù)據(jù)支撐[8-9].

1 材料和方法

1.1 材料

2010年11月采自封丘地黃資源圃中，9個主要種質(zhì)資源經(jīng)河南師范大學(xué)李發(fā)啟副教授鑒定,采用同樣的烘干粉碎方法獲得樣品.

1.2 儀器與試劑

Agilent 1200系列高效液相色譜儀，G1311A四元泵，自動控溫自動進樣器，G1316A柱溫箱，XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，F(xiàn)A2004N型電子天平、JH502型電子天平(上海精密科學(xué)有限公司)，Thermo自動雙重純水蒸餾器.乙腈、甲醇為色譜純，其他為分析純，水為二次蒸餾水；梓醇標(biāo)樣(蘋壹生物)，毛蕊花糖苷標(biāo)樣(四川維克奇生物科技有限公司).

2 實驗方法

2．1 梓醇

2.1.1色譜條件 以乙腈-0.1%磷酸溶液(1∶99)為流動相；檢測波長為210 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫25 ℃；進樣量10 μL.

2.1.2對照品溶液的制備 精密稱取梓醇對照品4.65 mg，置5 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻.

2.1.3供試品溶液的制備 精密稱定烘干粉碎后的地黃粉0.8 g，置錐形瓶中，加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流提取1.5 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，濃縮至近干，殘渣用流動相溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，并用流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得.

2.1.4測定法 對照品與供試品溶液各進樣10 μL進行液相色譜分析.按外標(biāo)峰面積法計算梓醇的含量.

2.3.3 監(jiān)護時間 患者在ICU滯留時間越長，與外界隔離時間越長，ICU環(huán)境及各種社會心理因素對患者的刺激就越大，患者由此而產(chǎn)生的不良情緒也越多，其發(fā)生ICU綜合征的概率也就越大。熊澗秋等［21］對430例體外循環(huán)術(shù)后ICU患者分析表明，滯留時間≥5 d的289例患者中有76例(26.3%)發(fā)生ICU綜合征，滯留時間＜5 d的141例患者中有17例(12.06%)發(fā)生ICU綜合征。提示患者滯留時間越長，其ICU綜合征發(fā)生率越高。

2.1.5線性關(guān)系 精密吸取上述對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置2 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻.將各個濃度的對照品溶液進樣10 μL進行液相色譜分析.以梓醇對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，梓醇峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為：Y=2 296.3X-19.817，r=0.999 9，梓醇在0.465～4.65 μL線性關(guān)系良好.

2.1.6精密度試驗 取同一對照品溶液，按含量測定方法及色譜條件進行測定，重復(fù)5次測定梓醇峰面積，RSD為0.19%.表明儀器精密度良好.

2.1.7穩(wěn)定性試驗 取對照品溶液及供試品溶液，于室溫分別放置0、2、4、8、10 h，按上述色譜條件進樣10 μL，測定梓醇峰面積，對照品及供試品的RSD分別為0.83%和0.76%.結(jié)果表明對照品及供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定.

2.1.8重復(fù)性試驗 精密稱取同一批地黃樣品3份，按含量測定方法進行測定，樣品的梓醇平均含量為1.47%，RSD為3.82%.表明本實驗方法重復(fù)性良好.

2.1.9數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS統(tǒng)計分析軟件進行計算和分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示結(jié)果.

2.2 毛蕊花糖苷(麥角甾苷)

2.2.1色譜條件 以乙腈-0.1%醋酸溶液(16∶84)為流動相；檢測波長為334 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量10 μL.

2.2.2對照品溶液的制備 精密稱取毛蕊花糖苷對照品8 mg，置50 mL 量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取2 mL，置10 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液.

2.2.3供試品溶液的制備 精密稱定烘干粉碎后的地黃粉0.8 g，置錐形瓶中，加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流提取1.5 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液20 mL，濃縮至近干，殘渣用流動相溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，并用流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得.

2.2.4測定法 對照品與供試品溶液各進樣10 μL進行液相色譜分析.按外標(biāo)峰面積法計算毛蕊花糖苷的含量.

2.2.6精密度試驗 取同一對照品溶液，按含量測定方法及色譜條件進行測定，重復(fù)5次測定毛蕊花糖苷的峰面積，RSD為0.97%.表明儀器精密度良好.

2.2.7穩(wěn)定性試驗 取對照品溶液及供試品溶液，于室溫分別放置0、2、4、8、10 h，按上述色譜條件進樣10 μL，測定毛蕊花糖苷峰面積，對照品及供試品的RSD分別為0.047%和0.23%.結(jié)果表明對照品及供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定.

2.2.8重復(fù)性試驗 精密稱取同一批地黃樣品3份，按含量測定方法進行測定，樣品的毛蕊花糖苷平均含量為3.95%，RSD為0.62%，表明本實驗方法重復(fù)性良好.

2.2.9數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS統(tǒng)計分析軟件進行計算和分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示結(jié)果.

3 結(jié)果與分析

3.1 同一產(chǎn)地不同地黃種質(zhì)資源產(chǎn)量的比較

在同一產(chǎn)地，分別隨機選取5個點，每個點按行連續(xù)取10株，測每個品種的單株鮮重，見圖1.

圖1 不同品種地黃產(chǎn)量比較Fig.1 Comparative studies on the strains of cultivars of Rehmannia

由圖1可知,9個品種(系)單株產(chǎn)量中，沁懷單株產(chǎn)量最高，且沁懷>北京3號>生津>懷地3號>脫毒苗85-5>85-5>懷地1號>北京1號>懷地2號.經(jīng)SPSS分析，沁懷與北京3號差異不顯著，與其他品種差異極顯著，脫毒苗85-5和85-5在產(chǎn)量上差異不顯著.

3.2 同一產(chǎn)地不同地黃種質(zhì)資源樣品中梓醇含量測定結(jié)果

以同樣的色譜條件分析梓醇標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，得到各樣品的梓醇含量見表1，高效液相色譜圖如圖2所示.

表1 樣品中梓醇含量測定結(jié)果Tab.1 Results of catalpol content in the samples

由表1可知：9個地黃樣品梓醇含量差異明顯，其中沁懷最高為3.70%，懷地1號最低為2.23%，均高于2010年藥典規(guī)定，且沁懷3.70%(對照)>懷地3號3.68%(P>0.05)>85-5 3.05%(P<0.01)>生津2.91%(P<0.01)>北京3號 2.55%(P<0.01)>懷地2號 2.31% (P<0.01)>脫毒苗85-5 2.30%(P<0.01)>北京1號 2.25%(P<0.01)>懷地1號 2.23%(P<0.01);脫毒苗85-5樣品梓醇含量低于非脫毒苗85-5的梓醇含量，且差異極顯著，有關(guān)機理有待進一步研究.由圖2各樣品的色譜圖的峰面積大小，也可以直觀地反映出樣品之間的差異.

3.3 同一產(chǎn)地不同地黃種質(zhì)資源樣品中毛蕊花糖苷含量測定結(jié)果

以同樣的色譜條件分析毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，得到各樣品的毛蕊花糖苷的含量見表2，高效液相色譜圖如圖3所示.

由表2可知，9個地黃品種樣品毛蕊花糖苷的含量差異明顯，其中85-5最高為0.13%，北京3號最低為0.03%，毛蕊花糖苷含量均都高于2010年藥典規(guī)定，且85-5 0.13%(對照)>北京1號 0.12%(P>0.05)>懷地2號 0.10%(P<0.01)=生津0.10%(P<0.01)>懷地3號0.08%(P<0.01)>懷地1號0.06%(P<0.01)>沁懷 0.04%(P<0.01)=脫毒苗85-5 0.04%(P<0.01)>北京3號0.03%(P<0.01)；脫毒苗85-5毛蕊花糖苷含量小于85-5，且差異極顯著，有關(guān)機理有待進一步研究．由圖3各樣品的色譜圖峰面積的大小，可直觀看出樣品之間的差異.

圖2 梓醇的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of catalpol

編號品種毛蕊花糖苷平均含量/%185-50.13±0.028aA2北京1號0.12±0.004abAB3北京3號0.03±0.001eF4生津0.10±0.004cBC5沁懷0.04±0.008deEF6懷地1號0.06±0.001dDE7懷地2號0.10±0.003bcBC8懷地3號0.08±0.007cCD9脫毒苗85-50.04±0.014deEF

圖3 毛蕊花糖苷的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of verbascoside

4 討論

根據(jù)大量文獻報道，地黃指標(biāo)成分含量差異較大，究其原因是地黃的品種及其生長環(huán)境、栽培措施、采樣收集時間及加工炮制方法不同等綜合因素造成的.本實驗將不同種質(zhì)資源栽種在同一塊試驗田中統(tǒng)一管理，并參照2010版《中國藥典》方法及相關(guān)文獻，采用高效液相色譜法測其成分，以盡量保證各品種的客觀條件基本平行，使測定結(jié)果更客觀、更真實地反映不同種質(zhì)資源之間成分含量和產(chǎn)量的差異.

通過對地黃同一產(chǎn)地9個品種(系)的產(chǎn)量試驗結(jié)果得出：沁懷>北京3號>生津>懷地3號>脫毒苗85-5>85-5>懷地1號>北京1號>懷地2號，從產(chǎn)量方面說明沁懷、北京3號、生津、懷地3號、脫毒苗85-5和85-5的產(chǎn)量比較高，可以在生產(chǎn)中推廣.

2010年版《中國藥典》將梓醇和毛蕊花糖苷納入地黃主要指標(biāo)性成分，并規(guī)定地黃中梓醇含量不得少于0.20%，毛蕊花糖苷含量不得少于0.020%.實驗結(jié)果9個地黃資源樣品梓醇含量范圍在2.23%～3.70%，毛蕊花糖苷含量范圍在0.03%～0.13%.兩種指標(biāo)性成分都遠(yuǎn)高于藥典規(guī)定的最低含量，說明懷地黃資源品質(zhì)比較好.

通過實驗數(shù)據(jù)分析可知，地黃不同種質(zhì)資源樣品間指標(biāo)成分含量差異明顯.其中梓醇含量：沁懷最高為3.70%(對照)>懷地3號3.68%(P>0.05)>85-5 3.05%(P<0.01)>生津 2.91%(P<0.01)>北京3號 2.55%(P<0.01)>懷地2號 2.31% (P<0.01)>脫毒苗85-5 2.30%(P<0.01)>北京1號 2.25%(P<0.01)>懷地1號 2.23%(P<0.01),毛蕊花糖苷含量：85-5 0.13%(對照)>北京1號 0.12%(P>0.05)>懷地2號 0.10%(P<0.01)=生津0.10%(P<0.01)>懷地3號0.08%(P<0.01)>懷地1號0.06%(P<0.01)>沁懷 0.04%(P<0.01)=脫毒苗85-5 0.04%(P<0.01)>北京3號0.03%(P<0.01).

綜合實驗結(jié)果分析可知，地黃產(chǎn)量與其指標(biāo)成分含量之間沒有相關(guān)性，地黃不同種質(zhì)資源樣品中2個指標(biāo)成分含量之間沒有相關(guān)性；85-5、生津、沁懷、懷地3號和北京1號都可以作為品質(zhì)育種的親本材料；指標(biāo)成分脫毒85-5明顯低于85-5且差異極顯著，究竟是什么原因造成其次生代謝產(chǎn)物差異的，機理有待進一步研究.

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