線粒體DNA突變合并腎臟損害

謝紅浪 許書添 何群鵬 楊 柳 郭錦洲 桂蘭蘭 陳惠萍 劉志紅

線粒體病是指因遺傳基因缺陷引起的線粒體結(jié)構(gòu)和功能異常導(dǎo)致的一組多系統(tǒng)細胞呼吸鏈及能量代謝異常的疾病。其中線粒體DNA(mtDNA)缺失或點突變使編碼線粒體氧化代謝過程必需的酶或載體發(fā)生障礙，線粒體不能利用糖原和脂肪酸等底物產(chǎn)生足夠的三磷酸腺苷(ATP)供細胞使用，從而導(dǎo)致能量代謝障礙。根據(jù)病變部位，通常將其分為線粒體肌病、線粒體腦肌病和線粒體腦病三類。

近年，隨著對線粒體基因結(jié)構(gòu)和功能的深入研究發(fā)現(xiàn)，線粒體病幾乎可導(dǎo)致全身各個器官和系統(tǒng)功能損害(如肌肉、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心臟、消化、內(nèi)分泌、眼等)，線粒體病合并腎臟損害的報道也逐漸增多［1－3］。本文報告3例合并腎臟損害的mtDNA點突變的患者，以期提高臨床醫(yī)師對此類疾病的認識和重視。

對象和方法

研究對象 2011年5月至2012年9月在南京軍區(qū)南京總醫(yī)院全軍腎臟病研究所住院、相互間無血源關(guān)系的3例患者，均經(jīng)臨床診斷線粒體病，分析其個人史和家庭史，腎臟損害的臨床特征、腎外多系統(tǒng)受累的表現(xiàn)，治療及預(yù)后，并分析腎臟病理特點。

所有患者及例2之父、母、弟均空腹留取EDTA抗凝血標本，分離外周血白細胞檢測mtDNA基因突變;3例患者同時送腎組織標本檢測mtDNA基因突變情況。

基因組標本準備 采用TIANamp Genomic DNA Kit提取外周血白細胞基因組DNA，DNA濃度＞100 ng/μl，體積﹥ 40 μl;純度均應(yīng)達到:260/280 ＞1.8，260/230＞1.2。

引物準備 將引物從原始的100p稀釋為10p(100p的原始引物10 μl+去離子水90 μl)。

PCR擴增

(1)將去離子水、PCR緩沖液、dNTP和Mg+溶液提前融化(注意:PCR緩沖液、dNTP和Mg+溶液必須完全融化才能使用)。

(2)體系:含有 dH2O 17.3 μl，10 × Buffer(含Mg+)2.5 μl，dNTP(2.5 mM)2 μl，引物(10p)2 μl，TAKARA 熱啟動 TaqE(5U/μl)0.2 μl，DNA 1.0 μl，總體積為 25 μl。

(3)PCR程序:變性開始階段為95.0℃，15 min，擴增階段為 95.0℃，30s;退火 58.0℃，30s，延伸72.0℃，30s，最終延伸 72.0℃，10 min，共擴增36圈。

(4)基因擴增所用的引物見表1。

表1 基因擴增引物

測序分析 根據(jù)堿基序列判斷檢測結(jié)果的是否存在mtDNA基因缺失或突變改變。

結(jié) 果

一般情況 3例患者中，男性2例，女性1例，年齡14～30歲。3例患者均無高血壓，體型偏瘦，例1和例2的體質(zhì)量指數(shù)(BMI)分別為13.3 kg/m2和13.5 kg/m2(表2)。

表2 3例患者的一般情況

個人史和家族史 例1生長和第二性征發(fā)育較同齡人遲緩伴智力障礙，例2有類固醇性糖尿病，例3為早產(chǎn)兒。例1及例2之母有糖尿病史，例2同時有尿毒癥家族史(表3)。

腎臟損害 發(fā)現(xiàn)腎臟病病程在7月內(nèi)。所有患者均以水腫和尿量減少起病，伴胱抑素C增高，2例合并低白蛋白血癥及高脂血癥。尿液檢查均無高血壓和鏡下血尿，但腎小管損傷明顯尿 N－乙酰－β－D－氨基葡萄糖苷酶和視黃醇結(jié)合蛋白升高(表4)。

表3 3例患者的個人史及家族史

表4 3例患者腎臟損害的特點

腎活檢組織病理 例1免疫熒光IgM++，呈顆粒狀彌漫沉積于系膜區(qū)及血管袢;光鏡示局灶節(jié)段腎小球硬化性病變(1/2腎小球廢棄)(圖1A)。例2免疫熒光IgM++，C3+，呈細顆粒狀彌漫沉積于系膜區(qū)及血管袢;光鏡示腎小球輕度系膜增生性病變但存在腎小動脈節(jié)段透明變性。2例患者腎組織IV型膠原α3、α5均正常。例3外院腎穿刺免疫熒光IgM+，光鏡示局灶節(jié)段性腎小球硬化性病變。

電鏡:例1腎小球節(jié)段袢塌陷，足細胞胞質(zhì)及腎小管上皮細胞胞質(zhì)內(nèi)見大小不一、形態(tài)不規(guī)則的線粒體(圖1B、C)。例2腎小球輕度系膜增生性病變，足細胞和腎小管上皮細胞胞質(zhì)見腫脹變形的線粒體，見雙核足細胞(圖1D)。例3無電鏡結(jié)果。

腎外損害 2例患者符合糖尿病診斷標準，糖化血紅蛋白明顯升高(7.8%～10.4%)，2例有高乳酸血癥(＞2.0 mmol/L)。神經(jīng)系統(tǒng)損害:癲癇發(fā)作(1例)，腦梗塞(1例)，聽力喪失(1例)，高頻聽力下降(2例)，智力障礙(2例)，視野缺失(1例)等。例1有心律失常(表5)。

基因診斷 3例患者均經(jīng)基因測序證實存在mtDNA 3243 A＞G突變位點，例2之母和弟弟也檢出與患者相同突變位點。例1和例2同時送檢腎活檢組織，未檢出相同突變位點。

治療及預(yù)后 例1和例2激素治療無效，經(jīng)對癥支持治療后，尿蛋白未轉(zhuǎn)陰。例3曾用激素+環(huán)磷酰胺沖擊治療無效，后佐以左卡尼汀、艾地苯醌、輔酶Q10等治療，蛋白尿部分緩解，血清肌酐穩(wěn)定(表5)。

圖1 線粒體病的腎組織活檢病理

表5 3例患者腎外損害的表現(xiàn)和預(yù)后

討 論

線粒體病的病因和發(fā)病機制 近10年來線粒體生物發(fā)展迅速。現(xiàn)已知人類線粒體DNA(mtDNA)約為16.6kb，編碼37個基因，包括22種tRNA，2種 rRNA和13種與呼吸鏈相關(guān)的蛋白質(zhì)［2］。原發(fā)性mtDNA異常包括點突變、缺失或重復(fù)等。點突變符合母系遺傳特點，mtDNA發(fā)生突變的概率比細胞核DNA(nDNA)高6～17倍，且不同細胞間的mtDNA突變量相差很大，具有異質(zhì)性。當mtDNA突變量達到一定閾值時，即可影響細胞功能導(dǎo)致臨床疾病，小劑量突變則不一定致病。

線粒體病幾乎可影響全身各個器官，臨床表現(xiàn)多種多樣。骨骼肌常表現(xiàn)為肌病、肌張力減退和運動能力減弱;中樞神經(jīng)系統(tǒng)呼吸暫停、低張性麻痹、嗜睡、運動神經(jīng)元病、共濟失調(diào)、卒中樣發(fā)作、偏癱、痙攣、癲癇、癡呆、腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、肌陣攣、皮質(zhì)盲、偏頭痛、多發(fā)性神經(jīng)病(感染或運動)及神經(jīng)元性膀胱等。感音性耳聾和心臟疾病發(fā)生率也很高(心肌病、心律失常及傳導(dǎo)阻滯等)，內(nèi)分泌異常引起糖尿病、甲狀旁腺功能減退、甲減、低腎素低醛固酮血癥和生長激素不足等。消化系統(tǒng)功能受損出現(xiàn)肝功能異常、腸動力紊亂(嘔吐、腹瀉和假性腸梗阻)和吸收不良。血液系統(tǒng)損害表現(xiàn)鐵粒幼細胞性貧血、中性粒細胞減少和血小板減少。眼部癥狀包括進行性外眼肌麻痹、眼肌麻痹、視網(wǎng)膜色素變性、上瞼下垂、白內(nèi)障、視神經(jīng)萎縮及失明。此外，還可累及皮膚和毛發(fā)。

線粒體病合并腎臟疾病的報道多見于兒童，常出現(xiàn)Fanconi綜合征或腎病綜合征、腎小管－間質(zhì)性疾病、Bartter綜合征和腎小管性酸中毒等。成人線粒體病與兒童不同，女性患者多見，多遵循母系遺傳特點;腎活檢以局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)最常見［3］，腎小管－間質(zhì)性疾病和多囊性疾病其次。兒童散發(fā)病例多見，女性不占優(yōu)勢，且FSGS的發(fā)生率低于腎小管－間質(zhì)疾?。?］。

編碼tRNALEU基因的3243位點A突變?yōu)镚是最經(jīng)典和最常見的mtDNA基因異常，該點突變最初在兒童MELAS綜合征患者(肌病、腦肌病、乳酸酸中毒和卒中樣發(fā)作)中證實，進一步研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病人群中該突變發(fā)生率高達1%，更常見糖尿病、耳聾、胃腸道和/或神經(jīng)肌肉癥狀。1997年一項大型研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者具母系遺傳特點和(或)感音性耳聾者，發(fā)生蛋白尿性腎臟疾病和終末期腎功能衰竭的比例特別高［5］。Emma 等［6］對 Alport患者重新篩查，從90例中發(fā)現(xiàn)了2例3243 A＞G突變者。在一項研究報道的27個3243 A＞G突變病例中，2/3(20/27)為女性，先證者之母或其他家庭成員多有糖尿病和(或)耳聾，確診年齡14～50歲。腎臟病理多表現(xiàn)為FSGS(22/27)，4例為慢性腎小管－間質(zhì)性腎炎，1例為多囊性腎臟疾病;其中2例見特殊的小動脈透明變性和肌細胞壞死樣病變。電鏡觀察通常無特殊發(fā)現(xiàn)，偶見足細胞或腎小管上皮細胞中集聚大量形態(tài)多樣的線粒體及雙核或多核的足細胞。

泛醌或輔酶Q10(CoQ10)是參與線粒體呼吸鏈電子穿梭的重要成分［7］，其編碼基因突變是另一種最常見mtDNA突變性疾病。Emma等［6］已在一些激素抵抗型腎病綜合征和腦肌病的兒童患者證實存在CoQ10合成缺陷和COQ2基因突變，COQ2基因主要編碼對羥苯甲酸聚戊烯轉(zhuǎn)移酶，參與CoQ10醌基合成。COQ2基因突變還見于一些遺傳性或早發(fā)性激素抵抗性腎病綜合征，COQ1－PDSS2基因［8］和COQ6基因［9］突變也可導(dǎo)致類似腎臟損害。此類疾病早期診斷尤為重要，因為是可治的一種線粒體缺陷，采用CoQ10［5～10 mg/(kg·d)］治療可改善臨床預(yù)后。

線粒體病的診斷 當患者具以下臨床特征時，應(yīng)考慮線粒?。?，10］:(1)不明原因的多個需氧器官受累，如糖尿病、神經(jīng)－肌肉病變、肥厚性心肌病和腎臟損害(腎病綜合征、Fanconi綜合征等);(2)具母系遺傳性家族性糖尿病;(3)伴感音性耳聾的糖尿病。

疑診線粒體病時，可先行靜息狀態(tài)下血清乳酸檢測，必要時檢測血液丙酮酸、肌酶、腦脊液乳酸、尿氨基酸和有機酸等，但這些并非線粒體病所特有，如運動后和危重患者均可出現(xiàn)血乳酸升高;近端小管功能損傷者可因尿液丟失增多而致血乳酸正常。骨骼肌活檢可見“破碎紅纖維”，但由于線粒體病的異質(zhì)性，肌肉活檢也可正常，故應(yīng)盡量選擇臨床功能受累的器官(如心肌)。評估呼吸鏈組分和功能的免疫組化、組化和分光光度計檢測方法，也有助線粒體病的診斷，但個體間差異較大?？扇∧I活檢組織送檢呼吸鏈復(fù)合物，骨骼肌送檢CoQ10，皮膚活檢獲取成纖維細胞經(jīng)培養(yǎng)后行CoQ10生物合成率生化檢測。

采用PCR檢測mtDNA點突變或Southern Blotting檢測基因缺失，是診斷線粒體病的金標準，但需鑒定突變基因的致病性，且可能遺漏nDNA突變。送檢標本選擇至關(guān)重要，最常送檢的標本為血液和肌肉，有作者報道從尿沉渣細胞中可檢出mtDNA 突變［11］。Hotta等［1］報道1 例伴嚴重腎功能衰竭的患者，其尿沉渣mtDNA突變的程度低，而患者之子雖無腎臟損害證據(jù)，卻從尿沉渣中檢出極高比例的mtDNA突變細胞。因此Hotta等［1］認為從尿沉渣中檢出mtDNA突變細胞并不能預(yù)測患者是否發(fā)病及疾病的嚴重程度。

國外已有大量線粒體病的研究(http:∥mitomap.org)及腎臟損害的報道，國內(nèi)也早已認識到線粒病可繼發(fā)腎臟損害［12，13］，但相關(guān)研究和病例報道較少［14，15］。Levinger等［16］報道，在出現(xiàn)臨床癥狀的患者中已證實150多種mtDNA的致病性點突變和100多種mtDNA缺失。本組3例患者均證實3243 A＞G突變。

本研究發(fā)現(xiàn)腎活檢病理并非能確診線粒體病腎臟損害，因為線粒體病的組織學(xué)改變無特征性，必需除外其他疾病繼發(fā)的FSGS。Hotta等［1］報道，其他原因繼發(fā)性FSGS(如腎發(fā)育不良、反流性腎病和肥胖相關(guān)性腎病等)的腎小球體積變異較大(8～16×106μm3，平均 12 ×106μm3)，而原發(fā)性 FSGS 的腎小球體積(3～6×106μm3，平均5×106μm3)明顯大于線粒體?。璅SGS者(2.5～4×106μm3，平均3.5×106μm3)，三組間統(tǒng)計學(xué)差異十分顯著。電鏡觀察線粒形態(tài)和數(shù)量異常也不具特異性，但雙核或多核足細胞可能有一定的診斷價值。Moulonguet等［3］報道，小動脈透明變性有提示診斷的意義，可能與小動脈肌細胞壞死有關(guān)，并導(dǎo)致FSGS病變。

本研究的不足之處為僅檢測部分患者家族成員mtDNA突變情況，且受檢測方法限制，未能檢測出突變與未突變細胞的比例。

總之，本文首次在國內(nèi)報道了3例伴腎臟損害的線粒體病患者，提示這類患者并非罕見，臨床醫(yī)師應(yīng)加強對此類疾病的認識。

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