纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

曾 露，李群良，嚴(yán) 偉，何查霖，何曙光

(1.廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.廣西來源生物動(dòng)力農(nóng)業(yè)投資有限公司，廣西 南寧 530008)

植物纖維素約占植物體干重的33.4％～50.0％,是地球上最豐富的有機(jī)物質(zhì)。但是，由于纖維素中存在許多高能的氫鍵，因此其水解、利用均很困難。世界上每年平均生成約1500億～2000億t植物性有機(jī)物，其中約有一半為纖維素類物質(zhì),而能利用的只有一小部分,絕大部分都被棄置[1]。因此，如何更有效地開發(fā)和利用纖維素資源已成為研究熱點(diǎn)。

纖維素酶是使纖維素分解生成葡萄糖的一組酶的總稱，其最大的潛在用途是將纖維類物質(zhì)酶法水解成葡萄糖。廣西每年種植甘蔗約100萬公頃，甘蔗葉作為蔗糖生產(chǎn)的廢棄物，約為1170萬t[2]。目前甘蔗葉主要以直接還田與焚燒為主，直接還田利用率低，肥效不高；而焚燒不僅浪費(fèi)資源，還污染環(huán)境，增加二氧化碳的排放，且容易引起火災(zāi)，影響航空和公路運(yùn)輸安全。因此急需尋求能合理利用甘蔗葉的途徑。作者從堆肥化處理的甘蔗葉中分離出一株高效纖維素酶產(chǎn)生菌，并對(duì)其產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種

從經(jīng)過堆肥化處理的甘蔗葉中篩選得到菌種。

1.2 培養(yǎng)基[3～5]

初篩培養(yǎng)基(纖維素剛果紅培養(yǎng)基)：CMC-Na 10 g，(NH4)2SO44 g，KH2PO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，NaCl 0.2 g，剛果紅0.20 g,瓊脂14 g，水1000 mL，pH值自然。

復(fù)篩培養(yǎng)基(CMC-Na培養(yǎng)基)：CMC-Na 10 g，(NH4)2SO44 g，KH2PO42.0 g，NaCl 0.2 g，剛果紅0.20 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蛋白胨1 g，瓊脂16 g,水1000 mL，pH值自然。

種子培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)：馬鈴薯200 g,蔗糖20 g，水1000 mL，pH值自然。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基(CMC-Na培養(yǎng)基)：CMC-Na 10 g，(NH4)2SO44 g，KH2PO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蛋白胨10 g，水1000 mL，pH值自然。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[6]

以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的濃度為橫坐標(biāo)、OD值為縱坐標(biāo),繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合線性方程為：y=6.8488x+0.0674。

1.4 纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選

采集的樣品按照常規(guī)稀釋。將稀釋倍數(shù)分別為104、105、106的樣品溶液涂布到纖維素剛果紅培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3 d,劃線分離四周有透明水解圈的菌株，然后純培養(yǎng)。將純化后的菌株用滅菌牙簽點(diǎn)種到纖維素剛果紅培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3 d。根據(jù)水解圈直徑(H)與菌落直徑(C)比值(H/C)的大小進(jìn)行初選。將初選的菌株接種于10 mL種子培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h，然后以3％(體積比)的接種量接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r·min-1條件下培養(yǎng)3 d，測(cè)定其酶活力，選取酶活較高的菌株接種于復(fù)篩培養(yǎng)基上，選取酶活最高的菌株作為進(jìn)一步研究的對(duì)象。

1.5 產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

將復(fù)篩獲得的菌株接種于初始pH值為8的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30 ℃、160 r·min-1條件下培養(yǎng)72 h，測(cè)定酶活。

分別對(duì)培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH值以及接種量等因素進(jìn)行優(yōu)化。

1.6 粗酶液的制備

取新鮮發(fā)酵液10 mL,4000 r·min-1下離心10 min，過濾，靜置，上清液即為粗酶液。

1.7 酶活力的測(cè)定

移取0.5 mL含有1％ CMC-Na的液體發(fā)酵培養(yǎng)基于試管中,加入0.5 mL粗酶液,于55 ℃水浴保溫10 min后，加入2.0 mL 3,5-二硝基水楊酸終止反應(yīng),煮沸10 min,取1 mL溶液稀釋10倍,用722型分光光度計(jì)于540 nm波長(zhǎng)下比色，對(duì)照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成葡萄糖質(zhì)量。

酶活力單位(U)定義：在上述條件下,每毫升粗酶液反應(yīng)1 min生成1 μg葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活力單位。

2 結(jié)果與討論

2.1 纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選

經(jīng)過平板分離，挑取透明圈較大的菌株。選取酶活力最高的菌株，命名為GXU-1，根據(jù)其菌落形態(tài)初步判斷其屬于霉菌。

2.2 產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

2.2.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶活力的影響(圖1)

圖1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶活力的影響

由圖1可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活力增大，即菌株產(chǎn)酶能力增強(qiáng)；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為72 h時(shí)，酶活力最高；培養(yǎng)時(shí)間超過72 h后，酶活力下降。因此，確定其最優(yōu)培養(yǎng)時(shí)間為72 h。

2.2.2 培養(yǎng)溫度對(duì)酶活力的影響(圖2)

圖2 培養(yǎng)溫度對(duì)酶活力的影響

由圖2可知，隨著培養(yǎng)溫度的升高，酶活力增大，即菌株產(chǎn)酶能力增強(qiáng)；當(dāng)培養(yǎng)溫度為30 ℃時(shí)，酶活力最高；培養(yǎng)溫度超過30 ℃后，酶活力下降。因此，確定最優(yōu)培養(yǎng)溫度為30 ℃。

2.2.3 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)酶活力的影響(圖3)

圖3 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)酶活力的影響

由圖3可知，隨著培養(yǎng)基初始pH值的增大，酶活力增大，即菌株產(chǎn)酶能力增強(qiáng)；當(dāng)初始pH值為8時(shí)，酶活力最高；初始pH值超過8后，酶活力下降。因此，確定最優(yōu)培養(yǎng)基初始pH值為8。

2.2.4 接種量對(duì)酶活力的影響(圖4)

圖4 接種量對(duì)酶活力的影響

由圖4可知，隨著接種量的增加，酶活力增大，即菌株產(chǎn)酶能力增強(qiáng)；當(dāng)接種量為3％時(shí)，酶活力最高，為90.19 U·mL-1；接種量超過3％后，酶活力變化不大，略有下降。

已報(bào)道的纖維素酶產(chǎn)生菌的酶活力一般較低，如盧月霞等[7]篩選的一株纖維素酶產(chǎn)生菌，其酶活力最高為44.76 U·mL-1；胡丹等[8]篩選的一株纖維素酶產(chǎn)生菌，其酶活力最高為75.72 U·mL-1，均低于作者篩選的纖維素酶產(chǎn)生菌GXU-1的酶活力?？梢奊XU-1是一株酶活力比較高的產(chǎn)纖維素酶優(yōu)勢(shì)菌株。如采用適當(dāng)?shù)姆椒▽?duì)其進(jìn)行誘變處理，該菌株的產(chǎn)酶能力可能還會(huì)有所提高。

3 結(jié)論

從甘蔗葉堆肥中分離出一株產(chǎn)纖維素酶能力較強(qiáng)的霉菌GXU-1，并對(duì)其產(chǎn)酶條件進(jìn)行了初步研究。確定菌株的最佳產(chǎn)酶條件為：培養(yǎng)時(shí)間72 h、培養(yǎng)溫度30 ℃、培養(yǎng)基初始pH值8、接種量3％，在此條件下，其酶活力達(dá)90.19 U·mL-1。

參考文獻(xiàn)：

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