外源酶對(duì)茶湯貯存過程中品質(zhì)的影響

黃彤

摘要：向茶湯中添加不同的外源酶，考察酶的種類、劑量、作用時(shí)間對(duì)改善茶湯貯存過程中褐變及沉淀現(xiàn)象的影響。結(jié)果表明，ｐＨ ５．５、４０ ℃條件下，０．０１５ Ｕ／ｍＬ單寧酶作用１．０ ｈ后，加入２．０ Ｕ／ｍＬ葡萄糖氧化酶，對(duì)茶湯的護(hù)色及防沉淀效果最好。

關(guān)鍵詞：茶湯；酶；護(hù)色；防沉淀

中圖分類號(hào)：ＴＳ２７２文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０12）15－3300-04

Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ Ｅｎｚｙｍｅ ｏｎ Ｔｅａ Ｂｅｖｅｒａｇｅ Ｑｕａｌｉｔｙ ｄｕｒｉｎｇ Ｓｔｏｒａｇｅ

ＨＵＡＮＧ Ｔｏｎｇ

（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ / Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ Ｃａｓｈ Ｐｌａｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｃｈｉｎａ， Ｙｉｎｂｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｙｉｂｉｎ ６４４０００， Ｓｉｃｈｕａｎ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Different ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｅｎｚｙｍｅｓ ｗｅｒｅ ａｄｄｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｂｅｖｅｒａｇｅ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｋｉｎｄ， ｄｏｓｅ ａｎｄ ａｃｔｉｎｇ ｔｉｍｅ ｏｎ ｂｒｏｗｎｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒｅｅｎ ｔｅａ ｂｅｖｅｒａｇｅ ｄｕｒｉｎｇ ｓｔｏｒａｇｅ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｃｏｌｏｒ－ｓｕｓｔａｉｎｉｎｇ ａｎｄ ａｎｔｉ－ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ａｄｄｉｎｇ ０．０１５ Ｕ／ｍＬ ｔａｎｎｉｎｓ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｎｇ ｆｏｒ １．０ ｈ， ｔｈｅｎ ａｄｄｉｎｇ ２．０ Ｕ／ｍＬ ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ ｕｎｄｅｒ ｐＨ ５．５， ４０ ℃．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｔｅａ ｂｅｖｅｒａｇｅｓ； ｅｎｚｙｍｅ； ｃｏｌｏｒ－ｓｕｓｔａｉｎｉｎｇ； ａｎｔｉ－ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ

茶葉中富含茶多酚、礦物質(zhì)、氨基酸、維生素和咖啡堿等多種成分，具有降壓、減肥、提神醒腦、利尿、明目等諸多功效。近年來(lái)，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，大量先進(jìn)技術(shù)的應(yīng)用在很大程度上促進(jìn)了茶飲料生產(chǎn)的迅速發(fā)展，茶已經(jīng)成為世界上消費(fèi)量最大的飲品之一。但是茶湯在貯藏過程中容易出現(xiàn)湯色褐變及乳狀沉淀的現(xiàn)象，在一定程度上制約了綠茶飲料的發(fā)展。研究人員曾試圖通過調(diào)節(jié)ｐＨ、使用包埋劑、添加金屬離子和抗氧化劑防止茶湯的褐變［１］，采用外源酶處理、金屬離子絡(luò)合、添加大分子膠體物質(zhì)、膜分離等方法防止沉淀的產(chǎn)生［２］。但已報(bào)道的對(duì)茶湯穩(wěn)定性的研究往往只集中于某一方面，或者護(hù)色，或者防止沉淀的產(chǎn)生。本試驗(yàn)擬通過在茶湯中添加外源酶來(lái)觀察茶湯貯存過程中色度、渾濁度及茶多酚等有效成分含量的變化，研究外源酶對(duì)茶湯貯存過程中預(yù)防色澤褐變和沉淀產(chǎn)生的作用，以期為茶飲料的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

１材料與方法

１．１材料與儀器

市售中檔屏山炒青（四川省屏山縣名優(yōu)茶總公司生產(chǎn)）、單寧酶（Ｔａｎｎａｓｅ，２００ Ｕ／ｇ，上海金穗生物科技有限公司）、木瓜蛋白酶（Ｐａｐａｉｎ，１ ０００ Ｕ／ｍｇ，上海源葉生物科技有限公司）、果膠酶（純度≥９９％，國(guó)藥試劑集團(tuán)）、葡萄糖氧化酶（ＧＯＤ，１００ Ｕ／ｍｇ，Ａｍｅｒｓｃｏ）。主要儀器設(shè)備包括電子天平、離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)、濁度測(cè)定儀等。

１．２試驗(yàn)方法

１．２．１茶湯的制備將茶葉粉碎過４０目篩，按茶水質(zhì)量比１∶１００加入８５ ℃熱水，保溫浸提１０ ｍｉｎ，待浸提液冷卻至室溫后４ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，取上清液封口保存?zhèn)溆谩?/p>

１．２．２添加外源酶對(duì)茶湯穩(wěn)定性影響的試驗(yàn)取茶湯，調(diào)至酶的最適ｐＨ，加入外源酶，在一定溫度下水浴酶解２ ｈ，離心滅菌后分別分裝在容量瓶中，密封，室溫放置，每隔１０ ｄ測(cè)定茶湯的色度、渾濁度，共測(cè)定３次，并于３０ ｄ后測(cè)定茶湯中茶多酚、咖啡堿、氨基酸和蛋白質(zhì)的含量。分別考察酶種類、酶用量和酶解時(shí)間等對(duì)茶湯穩(wěn)定性的影響。①單寧酶、木瓜蛋白酶、果膠酶對(duì)茶湯品質(zhì)的影響。取茶湯，分別加入單寧酶（０．０１ Ｕ／ｍＬ，ｐＨ ５．５、４０ ℃）、木瓜蛋白酶（５０ Ｕ／ｍＬ，ｐＨ ６．２、５０ ℃）、果膠酶（體積分?jǐn)?shù)０．００４％，ｐＨ ４．０、５０ ℃），在各種酶的最適反應(yīng)溫度下水浴酶解２ ｈ。②單寧酶劑量對(duì)茶湯品質(zhì)的影響。取茶湯，調(diào)ｐＨ為５．５，分別按０．００５、０．０１０、０．０１５、０．０２０、０．０２５、０．０３０ Ｕ／ｍＬ的劑量加入單寧酶，在４０ ℃下水浴酶解２ ｈ。③單寧酶酶解時(shí)間對(duì)茶湯品質(zhì)的影響。取茶湯，調(diào)ｐＨ為５．５，按０．０１０ Ｕ／ｍＬ的劑量加入單寧酶，在４０ ℃條件下分別水浴酶解０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０ ｈ。④葡萄糖氧化酶劑量對(duì)茶湯品質(zhì)的影響。?。保埃?ｍＬ茶湯，調(diào)ｐＨ為５．５，分別加入０、５０、１００、１５０、２００、２５０ Ｕ葡萄糖氧化酶，離心滅菌后分別分裝在４個(gè)容量瓶中，密封，室溫放置，每隔１０ ｄ打開１份，測(cè)定茶湯的色度、渾濁度，共測(cè)定３次，并于最后一次用第４個(gè)容量瓶測(cè)定茶多酚、咖啡堿、氨基酸和蛋白質(zhì)含量。⑤單寧酶和葡萄糖氧化酶復(fù)合作用對(duì)茶湯品質(zhì)的影響。?。保埃?ｍＬ茶湯，調(diào)ｐＨ為５．５，于４０ ℃下加入０．０１５ Ｕ／ｍＬ單寧酶處理１ ｈ，然后加入２.０ Ｕ／ｍＬ葡萄糖氧化酶，以不加單寧酶只加葡萄糖氧化酶和只加單寧酶不加葡萄糖氧化酶的茶湯作對(duì)照。

１．３茶湯品質(zhì)的測(cè)定

茶湯色度：４２０ ｎｍ比色法；茶湯渾濁度：使用濁度測(cè)定儀測(cè)定；茶多酚含量：酒石酸亞鐵比色法（ＧＢ／Ｔ ８３１３－２００８）；咖啡堿含量：紫外分光光度法（ＧＢ／Ｔ ８３１２－２００２）；氨基酸含量：水合茚三酮比色法（ＧＢ／Ｔ ８３１４－２００２）；蛋白質(zhì)含量：考馬斯亮藍(lán)Ｇ－２５０法。

２結(jié)果與分析

２．１酶種類對(duì)茶湯品質(zhì)的影響

不同種類的酶對(duì)茶湯貯存過程中品質(zhì)的影響結(jié)果見表１。由表１可知，經(jīng)單寧酶、木瓜蛋白酶和果膠酶處理的茶湯在貯存１０、２０、３０ ｄ后的渾濁度均小于空白對(duì)照，表明這３種酶均能減少沉淀的產(chǎn)生。茶飲料中的多酚類物質(zhì)是參與形成沉淀的主要組分，嚴(yán)重影響茶湯的澄清度和穩(wěn)定性。單寧酶是一種水解酶，作用于兒茶酚與沒食子酸間的酯鍵，水解酯型兒茶素生成沒食子酸和葡萄糖，沒食子酸又與茶黃素、茶紅素競(jìng)爭(zhēng)咖啡堿，形成小分子的水溶性化合物，從而降低茶湯的渾濁度，使茶湯保持澄清狀態(tài)［３］。貯存３０ ｄ后，單寧酶處理的茶湯渾濁度顯著低于對(duì)照（Ｐ＜０．０５），并且其茶多酚等有效成分的保留也最好。蛋白質(zhì)、果膠類物質(zhì)也是茶湯沉淀的重要組成部分［４］，木瓜蛋白酶將茶湯中的可溶性蛋白質(zhì)水解形成小分子氨基酸；果膠酶的作用是分解果膠形成可溶性糖類物質(zhì)［５］，從而降低茶湯的渾濁度。與對(duì)照相比，木瓜蛋白酶和果膠酶處理后茶湯的渾濁度均有所下降，但差異不顯著（Ｐ＞０．０５）。

對(duì)３０ ｄ后茶湯的色度進(jìn)行多重比較，發(fā)現(xiàn)各處理之間差異不顯著（Ｐ＞０．０５），表明單寧酶、木瓜蛋白酶和果膠酶均不能有效緩解茶湯貯存過程中色澤的改變。

２．２單寧酶對(duì)茶湯品質(zhì)的影響

２．２．１單寧酶劑量對(duì)茶湯品質(zhì)的影響單寧酶劑量不同，其對(duì)茶湯品質(zhì)的影響也不同。由表２可知，在酶劑量為０．００５～０．０１５ Ｕ／ｍＬ時(shí)，茶湯的渾濁度隨酶劑量的增加有下降的趨勢(shì)，當(dāng)酶劑量高于０．０１０ Ｕ／ｍＬ時(shí)，處理３０ ｄ后茶湯的渾濁度顯著低于對(duì)照處理；但各劑量單寧酶處理之間的渾濁度沒有顯著差異（Ｐ＞０．０５），可能的原因是低劑量的單寧酶就已經(jīng)能將茶湯中的酯型兒茶素完全水解。除0.005 Ｕ／ｍＬ處理外，不同劑量的單寧酶對(duì)茶湯的色澤均沒有顯著的改善作用（Ｐ＞０．０５）。從有效成分的含量來(lái)看，單寧酶劑量為０．０１５ Ｕ／ｍＬ時(shí)茶多酚的含量最高。

２．２．２單寧酶酶解時(shí)間對(duì)茶湯品質(zhì)的影響由表３可知，茶湯的渾濁度隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)有降低的趨勢(shì)，單寧酶酶解時(shí)間長(zhǎng)于１．５ ｈ時(shí)，貯存３０ ｄ后茶湯的渾濁度均顯著低于對(duì)照（Ｐ＜０．０５）；酶解時(shí)間長(zhǎng)于１．０ ｈ后，各單寧酶處理間渾濁度的差異不顯著（Ｐ＞０．０５）。同時(shí)，隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理茶湯的色度均逐漸增加，且３０ ｄ后單寧酶處理的茶湯色度均高于對(duì)照，這可能是保溫酶解的過程引起了茶湯中呈色物質(zhì)葉綠素和黃酮的變化。

２．３葡萄糖氧化酶對(duì)茶湯品質(zhì)的影響

茶湯中的多酚類等物質(zhì)很容易被氧化，使茶湯顏色變褐，葡萄糖氧化酶可利用葡萄糖作為底物發(fā)生氧化還原反應(yīng)除去茶湯中的氧，切斷多酚類等物質(zhì)的氧化途徑，阻止多酚類被氧化生成其他有色物質(zhì)，從而達(dá)到保護(hù)茶湯色澤的目的。從表４可知，貯存３０ ｄ后，茶湯的色度隨著葡萄糖氧化酶劑量的增加逐漸降低，葡萄糖氧化酶劑量大于１．０ Ｕ／ｍＬ時(shí)，茶湯的色度顯著低于對(duì)照（Ｐ＜０．０５）；當(dāng)葡萄糖氧化酶劑量超過1．5 Ｕ／ｍＬ時(shí)，茶湯的色度隨其劑量的增加沒有顯著變化（Ｐ＞０．０５）。從茶湯的渾濁度來(lái)看，葡萄糖氧化酶劑量為２.０ Ｕ／ｍＬ時(shí)渾濁度最小，顯著低于對(duì)照（Ｐ＜０．０５），且此時(shí)茶湯中有效成分茶多酚、咖啡堿等的保留情況較好。

２．４單寧酶和葡萄糖氧化酶復(fù)合作用對(duì)茶湯品質(zhì)的影響

單寧酶水解酯型兒茶素生成沒食子酸和葡萄糖，而葡萄糖是葡萄糖氧化酶在茶湯中的底物，因此單寧酶的存在有利于提高葡萄糖氧化酶的作用效率；而葡萄糖氧化酶的存在可以阻止多酚類物質(zhì)的氧化，使更多的多酚類被水解成小分子物質(zhì)，從而降低茶湯渾濁度［５］。從表５可以看出，單寧酶和葡萄糖氧化酶復(fù)合作用不僅能有效延緩茶湯貯存過程中色度的升高，而且能顯著減少茶湯沉淀的產(chǎn)生（Ｐ＜０．０５）。同時(shí)經(jīng)過兩種酶復(fù)合作用后，茶湯中的各主要有效成分含量均高于其他處理。

３結(jié)論與討論

茶湯沉淀的形成是茶湯中的茶多酚、咖啡堿、蛋白質(zhì)、多糖以及疏水性脂質(zhì)、金屬離子等物質(zhì)間相互作用的復(fù)雜過程［６］，如茶多酚可以分別與咖啡堿和可溶性蛋白質(zhì)形成絡(luò)合物沉淀，咖啡堿與蛋白質(zhì)也能形成絡(luò)合物沉淀［７，８］。茶湯的褐變則主要是由于茶多酚的氧化和葉綠素的分解［９］。茶多酚是茶湯中的主要有效成分，在貯藏過程中會(huì)氧化聚合形成茶黃素、茶紅素，使綠茶湯色發(fā)紅、發(fā)暗甚至褐變；形成綠茶湯色的重要色素——葉綠素也是一種不穩(wěn)定的色素，其在高溫和光照條件下發(fā)生取代反應(yīng)，形成褐色的去鎂葉綠素，從而使茶湯褐變。

本試驗(yàn)使用外源酶處理茶湯，以茶湯色度、渾濁度及茶多酚等有效成分含量為指標(biāo)，考察了不同因素對(duì)茶湯品質(zhì)的影響。結(jié)果顯示，單寧酶和葡萄糖氧化酶復(fù)合作用（０．０１５ Ｕ／ｍＬ單寧酶４０ ℃處理１ ｈ后加入２.0 Ｕ／ｍＬ葡萄糖氧化酶）不僅能有效防止綠茶茶湯色度的升高，而且減少了沉淀的產(chǎn)生，同時(shí)茶湯中的各主要有效成分保留情況良好。

隨著茶葉加工技術(shù)的不斷發(fā)展和酶技術(shù)應(yīng)用的深入，酶在茶葉加工中的研究愈來(lái)愈多，目前已成為茶葉加工的一大研究主題，但是在酶的使用中還應(yīng)注意解決以下幾個(gè)問題。

１）酶解條件。影響酶活性的因素很多，如酶促反應(yīng)的溫度、ｐＨ、與酶結(jié)合的輔基、底物和酶的比例、底物反饋抑制［１０］等，為了充分發(fā)揮酶的作用，必須注意加工工藝中相應(yīng)條件的優(yōu)化。

２）酶的分離提取。目前所使用的外源酶大多是從植物或微生物中提取分離，成本較高，且外源酶的活力也很難保持。提取分離高純度的外源酶并保持其活力是制約茶葉加工中外源酶應(yīng)用的關(guān)鍵因素。

３）酶的固定化。目前外源酶大多是以水溶性的狀態(tài)進(jìn)行作用，酶在整個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)中與底物、產(chǎn)物混在一起，難以回收利用［１１］，這種一次性使用酶的方式成本高，限制了酶在茶飲料加工領(lǐng)域的應(yīng)用。對(duì)于適合于茶飲料加工的酶種類，尋找合適的載體，將酶固定化，將有利于降低生產(chǎn)成本、提高生產(chǎn)效益。

另外，由于茶湯是一個(gè)很復(fù)雜的體系，影響其穩(wěn)定性的因素很多，采用單一方法難以獲得理想的效果，需多種方法結(jié)合起來(lái)使用，如酶法結(jié)合離心分離技術(shù)、膜分離技術(shù)等。目前關(guān)于這些技術(shù)綜合應(yīng)用的研究報(bào)道較少，也需要進(jìn)一步探討。

參考文獻(xiàn)：

［１］ 葉倩，梁月榮，陳瑞鴻． 綠茶飲料護(hù)色技術(shù)的研究進(jìn)展［Ｊ］．茶葉，２００６，３２（１）：１８－２２．

［２］ 寧井銘，方世輝．茶飲料防沉淀技術(shù)研究進(jìn)展［Ｊ］．茶業(yè)通報(bào)，２００４， ２６（１）：４１－４４．

［３］ 鄧軍，馬少敏，王榮輝． 單寧酶及其在茶飲料中的應(yīng)用［Ｊ］．廣西輕工業(yè)，２００９，（３）：６－７，１７．

［４］ 李小滿． 茶飲料關(guān)鍵控制點(diǎn)及其處理的研究［Ｊ］． 廣州食品工業(yè)科技，２００１，１７（１）：８０－８２．

［５］ 寧井銘，方世輝，夏濤，等． 單寧酶及協(xié)同物質(zhì)對(duì)綠茶飲料穩(wěn)定性的影響［Ｊ］． 食品與發(fā)酵工業(yè)，２００６，３２（６）：６９－７２．

［６］ 曾海賓，朱?。?茶飲料沉淀機(jī)理及解決途徑的探討［Ｊ］． 福建輕紡，２００３，１０（１１）：４８－５０．

［７］ 吳雅紅，羅宗銘．茶多酚與咖啡堿相互作用對(duì)綠茶飲料質(zhì)量的影響［Ｊ］． 廣東工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，２００５，２２（２）：２１－２５．

［８］ 苗愛清，伍錫岳，龐式． 茶飲料沉淀的成因及解決措施［Ｊ］． 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，２００１（３）：１３－１５．

［９］ 孫世利，潘順順，凌彩金，等． 綠茶飲料湯色褐變機(jī)理及其影響因素［Ｊ］．廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)， ２００８（１１）：７５－７７．

［１０］ 肖文軍，劉仲華，黎星輝． 茶葉加工中的外源酶研究進(jìn)展［Ｊ］．天然產(chǎn)物研究與開發(fā)， ２００３，１５（３）：２６４－２６７．

［１１］ 鄧軍，馬少敏，王榮輝．單寧酶及其在茶飲料中的應(yīng)用［Ｊ］． 廣西輕工業(yè)，２００９，２５（３）：６－７，１７．