茅莓總黃酮提取工藝的優(yōu)化

劉德勝 鄭紅 韓景田

摘要：從茅莓（Ｒｕｂｕｓ ｐａｒｖｉｆｏｌｉｕｓ Ｌ．）中提取總黃酮，采用吸光光度法測定提取液中總黃酮的濃度。在單因素試驗的基礎上采用Ｌ９（３４）正交試驗考察乙醇體積分數(shù)、料液比、超聲處理時間及提取溫度對總黃酮提取率的影響。結(jié)果表明，茅莓莖中總黃酮最佳提取工藝條件為乙醇體積分數(shù)３０％、料液比１∶５０（ｍ∶Ｖ，ｇ／ｍＬ）、提取溫度８０ ℃、超聲處理時間９０ ｍｉｎ，此工藝條件下茅莓莖中總黃酮提取率為４．７ ｍｇ／ｇ，此時葉中總黃酮的提取率高達１２．２ ｍｇ／ｇ，遠高于根和莖中的。

關(guān)鍵詞：茅莓（Ｒｕｂｕｓ ｐａｒｖｉｆｏｌｉｕｓ Ｌ．）；總黃酮；提取工藝；優(yōu)化

中圖分類號：Ｒ２８４．２文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）15－3295-03

Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｔｏｔａｌ Ｆｌａｖｏｎｅｓ ｆｒｏｍ Ｒｕｂｕｓ ｐａｒｖｉｆｏｌｉｕｓ

ＬＩＵ Ｄｅ－ｓｈｅｎｇ，ＺＨＥＮＧ Ｈｏｎｇ，ＨＡＮ Ｊｉｎｇ－ｔｉａｎ

（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｂｉｎｚｈｏｕ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｙａｎｔａｉ ２６４００３，Ｓｈａｎｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｗｅｒｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｒｕｂｕｓ ｐａｒｖｉｆｏｌｉｕｓ Ｌ．， the ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｌａｖｏｎes ｉｎ ｅｘｔｒａｃｔａｎｔ ｗａｓ detected by ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ． Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｔｏ ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ， ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ， ｖｏｌｕｍｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｃｏｈｏｌ ｓｏｌｖｅｎｔ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｌ９（３４） ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｅｓｔｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ， ｖｏｌｕｍｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｔｈａｎｏｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ， ３０％； ｓｏｌｉｄ－ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ， １∶５０（ｍ∶Ｖ，ｇ／ｍＬ）； ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ８０ ℃； ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ， ９０ ｍｉｎ． Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅｓｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｉｎ Ｒ． ｐａｒｖｉｆｏｌｉｕｓ ｓｔｅｍ ｒｅａｃｈｅｄ ４．７ ｍｇ／ｇ． Ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｉｎ Ｒ． ｐａｒｖｉｆｏｌｉｕｓ ｌｅａｆ ｗａｓ １２．２ ｍｇ／ｇ， ｍｕｃｈ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｅｍ ａｎｄ ｒｏｏｔ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｒｕｂｕｓ ｐａｒｖｉｆｏｌｉｕｓ Ｌ．； ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｅｓ； ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ； ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ

茅莓（Ｒｕｂｕｓ ｐａｒｖｉｆｏｌｉｕｓ Ｌ．）又名紅梅消、天青地白草等，系薔薇科懸鉤子屬落葉小灌木，生于山坡、路旁荒地、灌叢和草叢中，適應性強，分布于河北、山西、陜西、四川以及中南和華東各省，資源十分豐富［１］。茅莓為民間常用草藥，其根、莖、葉均可作藥用，具有清熱涼血、止血、散結(jié)止痛、利尿消腫等功效［２］。茅莓含有皂苷［３，４］、黃酮［５］、酚酸類物質(zhì)［６］、萜類［７］以及揮發(fā)油［８］等多種有效成分，其中黃酮類化合物具有良好的抗氧化性能，具有清除人體中超氧離子自由基、抗衰老、增加機體免疫力、降血壓、降血脂及抗腫瘤等功能［８］，茅莓的功效與其所含黃酮類化合物有著密切聯(lián)系。本研究采用正交試驗優(yōu)化茅莓中總黃酮的提取工藝，以期為進一步綜合利用茅莓資源提供參考依據(jù)。

１材料與方法

１．１材料與儀器

茅莓采自山東省煙臺市昆崳山國家級自然保護區(qū)，經(jīng)濱州醫(yī)學院中西醫(yī)結(jié)合學院劉孟安教授鑒定為薔薇科懸鉤子屬植物茅莓（Ｒｕｂｕｓ ｐａｒｖｉｆｏｌｉｕｓ Ｌ．）。蘆丁標準品（１０００８０－２００３０６）由中國藥品生物制品檢定所提供，AlCl3、甲醇、乙醇等均為國產(chǎn)分析純。

ＴＵ－１９０１雙光束紫外可見光分光光度計（北京普析通用儀器責任有限公司）；ＲＥ－５２Ａ旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化設備儀器有限公司）；ＳＨＢ－ＩＩＩ循環(huán)水式多用真空泵、ＤＦ－１０１Ｓ集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；Ｄ２Ｆ－６０５０型真空干燥箱、ＰＨＧ－９２４６Ａ型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏試驗設備有限公司）；ＨＹ４０Ｂ型高速粉碎機（北京環(huán)亞天元機械技術(shù)有限公司）；ＥＬ２０４－電子天平（梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司）；ＫＱ－４００ＤＢ型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ＷＤ－２１０５Ａ微型離心機（北京市六一儀器廠）。

１．２方法

１．２．１樣品預處理將茅莓莖洗凈后置烘箱中８０ ℃烘干、粉碎、過６０目篩，得試驗用粉末樣品，陰涼干燥處密閉保存。稱?。保埃?ｇ樣品，石油醚（沸程６０～９０ ℃）回流２～４ ｈ脫色素，進行多次脫色至石油醚無色，過濾，濾渣烘干。

１．２．２超聲輔助法提取茅莓中的總黃酮稱取預處理后的茅莓莖粉末１．０ ｇ，置２５０ ｍＬ三角瓶中，加入一定體積分數(shù)的乙醇，稱重，設定超聲功率和溫度，超聲處理一定時間后取出放至室溫，稱重，用相同體積分數(shù)的乙醇補充至原重。過濾，得茅莓總黃酮提取液。

１．２．３單因素試驗以黃酮提取率為指標，設置單因素試驗分別考察料液比、提取溫度、超聲處理時間、乙醇濃度的影響。①料液比。提取溫度６０ ℃、超聲處理時間９０ ｍｉｎ、乙醇體積分數(shù)５０％，料液比分別為１∶２０、１∶３０、１∶４０、１∶５０（ｍ∶Ｖ，ｇ／ｍＬ，下同）。②提取溫度。料液比１∶４０、超聲處理時間９０ ｍｉｎ、乙醇體積分數(shù)５０％，提取溫度分別為５０、６０、７０、８０ ℃。③超聲處理時間。料液比１∶４０、提取溫度７０ ℃、乙醇體積分數(shù)５０％，超聲處理時間分別為３０、６０、９０、１２０ ｍｉｎ。④乙醇體積分數(shù)。料液比１∶４０、提取溫度７０ ℃、超聲處理時間１２０ ｍｉｎ，乙醇體積分數(shù)分別為２０％、３０％、４０％、５０％。

１．２．４正交試驗采用Ｌ９（３４）正交試驗考察料液比、提取溫度、超聲處理時間和乙醇體積分數(shù)對總黃酮提取率的影響，因素與水平見表1。

１．２．5總黃酮含量的測定［９－１１］①標準曲線的繪制。精確稱取干燥至恒重的蘆丁對照品，用無水甲醇配成濃度為１４０．０ μｇ／ｍＬ的對照品溶液，準確吸取對照品溶液０．０、０．１、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０ ｍＬ分別置于１０ ｍＬ容量瓶中，加１０ ｇ／Ｌ AlCl3溶液０．５ ｍＬ，搖勻，放置１５ ｍｉｎ，以無水甲醇定容至１０ ｍＬ，以空白作為對照，１５ ｍｉｎ后于４２５ ｎｍ波長處測定吸光度。得到吸光度（Ａ）對濃度（Ｃ//μｇ／ｍＬ）的回歸方程Ａ＝３２３．２８７ ６４Ｃ－０．７７０ ４６，Ｒ２＝０．９９９ ８，線性范圍為１.４～１４.０ μｇ／ｍＬ。②樣品中總黃酮含量的測定。?。?ｍＬ樣品溶液于１０ ｍＬ容量瓶中，按標準曲線的繪制方法顯色，測定吸光度。根據(jù)回歸方程求出提取液中總黃酮的濃度，并利用下式求出總黃酮提取率。

Ｗ＝Ｃ×Ｎ×Ｖ／ｍ×１０－３

式中，Ｗ為總黃酮的提取率（ｍｇ／ｇ），Ｎ為稀釋倍數(shù)，Ｖ為提取液總體積（ｍＬ），ｍ為茅莓莖的質(zhì)量（ｇ），Ｃ為總黃酮提取液的濃度（μｇ／ｍＬ）。

２結(jié)果與分析

２．１單因素試驗結(jié)果

２．１．１料液比對茅莓總黃酮提取率的影響由圖１可知，隨著提取劑乙醇用量的增加，茅莓總黃酮提取率先增加，料液比為１∶４０時總黃酮提取率最高。當黃酮類物質(zhì)完全溶出之后，再加大提取劑的用量，總黃酮的提取率略有下降，且不利于后期的產(chǎn)物濃縮和提純。

２．１．２提取溫度對茅莓總黃酮提取率的影響由圖２可知，總黃酮提取率隨著提取溫度的升高而升高，但提取溫度高于７０ ℃時，提取率隨溫度升高而升高的趨勢變得平緩。較高的提取溫度有利于有效成分的溶出，但過高的溫度會引起總黃酮的降解，反而降低提取效率。

２．１．３提取時間對茅莓總黃酮提取率的影響由圖３可知，茅莓總黃酮提取率隨著提取時間的延長而呈升高趨勢，提取時間由５０ ｍｉｎ延長至６０ ｍｉｎ時，提取率的上升幅度較大。但當提取時間長于６０ ｍｉｎ時，提取率隨時間延長而升高的幅度較小。

２．１．４乙醇體積分數(shù)對茅莓總黃酮提取率的影響由圖４可知，總黃酮提取率隨提取溶劑乙醇體積分數(shù)的增加呈先升高后降低的趨勢。乙醇體積分數(shù)為４０％時提取率最高，過高或過低的提取劑濃度都不利于總黃酮的溶出。

２．２正交試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果見表２。由表２可知，４因素中料液比對黃酮提取率的影響最大，提取溫度和乙醇體積分數(shù)次之，超聲處理時間的影響最小。方差分析結(jié)果表明，料液比、提取溫度和乙醇體積分數(shù)對茅莓莖中總黃酮提取率的影響顯著，而超聲處理時間對總黃酮的提取率沒有顯著影響。茅莓總黃酮提取的最佳工藝條件為Ａ３Ｂ３Ｃ３Ｄ１，即料液比１∶５０，提取溫度８０ ℃，超聲處理時間１２０ min，乙醇體積分數(shù)３０％。由于超聲處理時間對總黃酮提取率的影響不顯著，從節(jié)約試驗成本簡化操作的角度考慮，在實際操作中選用９０ ｍｉｎ的處理時間。在此條件下總黃酮的提取率為４．７ ｍｇ／ｇ，高于其他試驗組合。按此條件進行驗證試驗，從茅莓莖中提取總黃酮，重復３次，總黃酮的提取率分別為４．８、４．７、４．６ ｍｇ／ｇ，說明正交試驗結(jié)果是可靠的。

２．３茅莓不同部位總黃酮含量的測定

精確稱取干燥的茅莓根、莖、葉粉末各１．０ ｇ，按正交試驗優(yōu)化后的工藝提取總黃酮，根、莖、葉中總黃酮的提取率分別為４．２、４．７、１２．２ ｍｇ／ｇ，表明茅莓的葉片中總黃酮的含量和提取率遠高于根和莖中的，可作為茅莓總黃酮提取的主要取材部位。

３結(jié)論

通過單因素試驗和正交試驗，優(yōu)化得到茅莓莖中總黃酮的提取工藝為料液比１∶５０（ｍ∶Ｖ，ｇ／ｍＬ）、提取溫度８０ ℃、超聲處理時間９０ min、乙醇體積分數(shù)３０％，此時茅莓總黃酮提取率最高，為４．７ ｍｇ／ｇ。提取工藝穩(wěn)定性和重復性好、簡單可行、省時節(jié)能，適于工業(yè)化生產(chǎn)。茅莓葉中的總黃酮含量和提取率遠高于根和莖中的，這為茅莓資源的利用和進一步開發(fā)提供了依據(jù)。

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