左歸丸含藥血清通過(guò)ERK/TGF-β/Smads信號(hào)級(jí)聯(lián)調(diào)控MC3T3-E1細(xì)胞增殖與分化*

蒿長(zhǎng)英， 任艷玲△， 劉立萍， 宋 囡， 王智民

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2附屬第二醫(yī)院，3第一臨床學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110032)

1000-4718(2012)09-1670-06

2012-04-18

2012-07-20

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30873226);教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)目(No.20102133110001);遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀人才支持計(jì)劃資助項(xiàng)目(No.LR201025)

△通訊作者 Tel: 024-31207267; E-mail: yanlingren@tom.com

左歸丸含藥血清通過(guò)ERK/TGF-β/Smads信號(hào)級(jí)聯(lián)調(diào)控MC3T3-E1細(xì)胞增殖與分化*

蒿長(zhǎng)英1， 任艷玲1△， 劉立萍1， 宋 囡2， 王智民3

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2附屬第二醫(yī)院，3第一臨床學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110032)

目的研究細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)/轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)/Sma和Mad相關(guān)蛋白(Smads)信號(hào)級(jí)聯(lián)在左歸丸含藥血清干預(yù)成骨前體細(xì)胞系MC3T3-E1細(xì)胞增殖與分化中的作用。方法以倍美力為陽(yáng)性對(duì)照藥，對(duì)Sprague-Dawley (SD)雌性大鼠灌服高、中、低劑量的左歸丸混懸液，7 d后腹主動(dòng)脈取血分離含藥血清。采用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)左歸丸含藥血清對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖作用，采用改良鈣鈷染色法檢測(cè)堿性磷酸酶(ALP)表達(dá)，采用茜素紅染色法檢測(cè)鈣化結(jié)節(jié)，采用Western blotting法檢測(cè)核結(jié)合因子α1(Cbfα1)和Ⅰ型膠原(ColⅠ)蛋白表達(dá)，采用real-time RT-PCR法檢測(cè)TGF-β1、Smad4和Smad2 mRNA表達(dá)。結(jié)果左歸丸含藥血清對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的促增殖作用呈劑量和時(shí)間相關(guān)性，其中以低劑量且體積分?jǐn)?shù)為15%作用48 h后對(duì)MC3T3-E1的促增殖作用最大；左歸丸含藥血清能促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞ALP表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞基質(zhì)鈣化，提高Cbfα1和ColⅠ蛋白分泌，上調(diào)TGF-β1、Smad4和Smad2 mRNA表達(dá)；加入ERK1/2信號(hào)通路特異性阻滯劑PD98059后，MC3T3-E1細(xì)胞增殖降低，ALP表達(dá)下降，細(xì)胞基質(zhì)鈣化減弱，Cbfα1和ColⅠ蛋白分泌降低，Smad4和Smad2 mRNA表達(dá)下調(diào)，TGF-β1mRNA表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)。結(jié)論左歸丸可能通過(guò)干預(yù)ERK/TGF-β/Smads信號(hào)級(jí)聯(lián)而調(diào)控成骨細(xì)胞的增殖和分化，這可能是其防治骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制之一。

左歸丸； 細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶類； 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β； Smad蛋白類； MC3T3-E1細(xì)胞

細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)以及Sma和Mad相關(guān)蛋白(Sma-and Mad-related proteins,Smads)在信號(hào)網(wǎng)中發(fā)揮基本的作用。ERK以一種調(diào)控的方式使細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核信號(hào)，激活特異的靶點(diǎn)和基因過(guò)程[1]。相比其它組織，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor β,TGF-β)在骨基質(zhì)中最豐富,以非活化的形式存在，從骨基質(zhì)釋放，在骨微環(huán)境中被激活；其由成骨細(xì)胞(osteoblast, OB)分泌，以多種形式調(diào)控骨代謝，誘導(dǎo)骨骼發(fā)育和骨重建[2]。Smad2/3蛋白為轉(zhuǎn)錄因子，與通用型Smad4蛋白結(jié)合形成異源三聚體，將TGF-β超家族[包括骨形成蛋白4(bone marphogenic protein4，BMP-4)]激活的細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞核以調(diào)控目的基因轉(zhuǎn)錄[3]。前期研究顯示，補(bǔ)腎健脾和補(bǔ)腎益氣生精中藥可以從蛋白及mRNA水平提高大鼠OB或骨組織中的TGF-β1及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子 Smad2和Smad4表達(dá)。買霞等[4]研究發(fā)現(xiàn)，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF) 可活化 Ras/ERK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs) 向OB分化。本文擬探討左歸丸含藥血清對(duì)小鼠成骨前體細(xì)胞系MC3T3-E1細(xì)胞ERK1/2和TGF-β1/Smads信號(hào)通路的干預(yù)作用，以期明確左歸丸治療骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1材料

SD雌性大鼠SPF級(jí)，180～200 g，購(gòu)于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)為SCXK(滬)2008-0016。小鼠成骨前體細(xì)胞系MC3T3-E1 Subclone 14購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

2藥物、主要試劑及儀器

左歸丸(上海雷允上封浜)；倍美力(Premarin,BML)結(jié)合雌激素片(愛(ài)爾蘭惠氏藥廠)；改良型α-MEM培養(yǎng)液和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(HyClone)；胰酶、MTT、PD98059(ERK1/2信號(hào)通路特異性阻滯劑)、茜素紅 (Sigma)；兔抗核結(jié)合因子α1(core binding factor α1,Cbfα1)抗體和兔抗I型膠原(collagenⅠ,Col I)抗體(Abcam)；ECL發(fā)光液(Pierce)；real time RT-PCR試劑盒(TaKaRa)；引物委托TaKaRa公司設(shè)計(jì)合成，具體信息見(jiàn)表1。3111型CO2培養(yǎng)箱(Thermo)；HFsafe-1200型生物安全柜(上海力申)；DFC320型倒置顯微鏡(Leica)；Western blotting系統(tǒng)(Bio-Rad)；BioSpec-nano型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) (島津)；iMark型酶標(biāo)儀(Bio-Rad)；Mx3000P型real-time PCR儀(Agilent)。

3主要方法

3.1含藥血清的制備 將大鼠隨機(jī)分為5組：空白對(duì)照組(control)30 只、左歸丸高、中、低劑量組[ZG(H、M、L)]各31只和倍美力組(BML)31只。大鼠左歸丸的等臨床劑量為1.6 g·kg-1，此設(shè)為ZG(L)，以其2倍為ZG(M)，4倍為ZG(H)；BML組給予結(jié)合雌激素56.25 μg·kg-1；control組灌服蒸餾水10 mL·kg-1。藥物制成混懸液，每天2 次灌服，持續(xù)灌胃7 d。于第8 d給藥2 h后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置2 h，2 500 r/min 4 ℃離心20 min，收集血清，同組混勻，56 ℃水浴滅活30 min，過(guò)濾除菌，分裝，-86 ℃保存。

3.2左歸丸含藥血清有效作用濃度和時(shí)間的篩選 MC3T3-E1細(xì)胞第3 代經(jīng)胰酶消化，用含10%(V/V)FBS的基礎(chǔ)培養(yǎng)液(含1×105U·L-1青霉素、100 mg·L-1硫酸鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)液)稀釋成2×108L-1的細(xì)胞懸液，以每孔200 μL接種于96孔培養(yǎng)板，調(diào)零孔不加細(xì)胞，24 h后換用含0.2%(V/V)FBS的基礎(chǔ)培養(yǎng)液；24 h后換用含10%、15%或20%各組含藥血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)液100 μL，每一濃度8復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72或96 h。每孔加入5 g·L-1的MTT溶液10 μL，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h后，棄孵育液，每孔加入100 μL DMSO，振蕩混勻15 min。待沉淀完全溶解后，酶標(biāo)儀上490 nm測(cè)定吸光度(A)值。

3.3實(shí)驗(yàn)分組及藥物干預(yù) 細(xì)胞隨機(jī)分為control組、PD98059(PD)組、ZG(L)組、ZG(L)+PD98059組、BML組和BML+PD98059組。MC3T3-E1細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，用含10%(V/V) FBS的基礎(chǔ)培養(yǎng)液稀釋成2×108L-1的細(xì)胞懸液，接種。24 h后換含0.2%(V/V) FBS的基礎(chǔ)培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)，使細(xì)胞同步化；24 h后換用含或不含10 μmol/L PD98059(溶于DMSO，DMSO體積濃度≤0.0001，-20 ℃避光保存)的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，預(yù)孵育30 min后加入各組含藥血清，繼續(xù)培養(yǎng)。每3 d換1次液。

3.4改良鈣鈷法檢測(cè)MC3T3-E1細(xì)胞堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)表達(dá) ALP染色孵育液由3%β-甘油磷酸鈉、2%巴比妥鈉、2%無(wú)水氯化鈣、2%硫酸鎂和蒸餾水5 mL組成(pH 9.4)。ALP陰性對(duì)照液不含β-甘油磷酸鈉。MC3T3-E1細(xì)胞以每孔500 μL接種于24孔培養(yǎng)板，藥物干預(yù)14 d后，棄原培養(yǎng)液，95%乙醇固定15 min，干燥；加入新鮮配制的孵育液，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h；流水洗10 min；2%硝酸鈷作用5 min；蒸餾水洗片刻；1%硫化銨水溶液(現(xiàn)配用)處理1 min；蒸餾水沖洗。晾干，顯微鏡下拍照(10×20)。

3.5茜素紅染色法檢測(cè)MC3T3-E1細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié) 0.1%茜素紅溶液：茜素紅100 mg，Tris-HCl (pH 8.3) 100 mL；混勻，充分溶解，4 ℃避光保存。MC3T3-E1細(xì)胞以每孔1 000 μL接種于24孔培養(yǎng)板，藥物干預(yù)14 d后，棄原培養(yǎng)液，PBS洗2次；95%乙醇固定10 min；PBS洗3次；0.1%茜素紅-Tris-HCl(pH 8.3) 37℃孵育30 min；自來(lái)水沖洗，室溫干燥。在低倍鏡視野(4×10)下拍照。

3.6MC3T3-E1細(xì)胞ColⅠ和Cbfα1蛋白表達(dá)檢測(cè) MC3T3-E1細(xì)胞第6代以每瓶3×106接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，藥物干預(yù)48 h后棄原培養(yǎng)液，蛋白提取試劑提取總蛋白，4 ℃ 12 000×g離心10 min，取上清；BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度；與5×SDS上樣緩沖液100 ℃煮沸5 min，60 μg/well加入12%SDS-PAGE凝膠中，電泳，轉(zhuǎn)膜3 h，5%質(zhì)量濃度的脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，Ⅰ抗4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗3次，Ⅱ抗37 ℃孵育2 h，TBST洗4次，暗室中ECL發(fā)光并用X膠片曝光，膠片掃描并分析結(jié)果。

3.7TGF-β1、Smad4、Smad2 mRNA表達(dá) RNAiso Plus試劑盒提取細(xì)胞總RNA，吸光度測(cè)定方法檢測(cè)RNA質(zhì)量。理想的RNA純度A260/A280應(yīng)在1.8 ～2.2范圍內(nèi)?；蚪MDNA去除體系：5 μL 200 mg/L total RNA，2.0 μL 5×gDNA Eraser Buffer，1.0 μL gDNA Eraser，2.0 μL RNase Free dH2O；PCR儀反應(yīng)：(1)42 ℃ 2 min；(2)4 ℃保存。RT反應(yīng)體系：去除基因組DNA的總RNA，4 μL 5×PrimeScript Buffer 2(for real time)，1 μL PrimeScript RT Enzyme MixⅠ，1 μL RT Primer Mix，RNase Free dH2O 4 μL；PCR儀反應(yīng)：(1)37 ℃ 15 min；(2)85 ℃ 5 s；(3)4 ℃保存。標(biāo)準(zhǔn)品cDNA 5倍梯度稀釋，稀釋6個(gè)梯度；各組cDNA樣品5倍稀釋；在每個(gè)0.2 mL 8聯(lián)PCR反應(yīng)管中加入23 μL PCR反應(yīng)液[9.5 μL RNase Free dH2O，0.5 μL上游引物，0.5 μL下游引物，12.5 μL SYBR Premix Ex TaqⅡ(2×Tli RNaseH Plus)，并在每個(gè)反應(yīng)管中加入2 μL cDNA[negative control(NTC)加2 μL EASY dilution]，PCR儀中real-time PCR反應(yīng)：(1)95 ℃ 2 min；(2)95 ℃ 30 s；60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。根據(jù)NTC反應(yīng)有無(wú)熒光信號(hào)檢出，并結(jié)合熔解曲線確認(rèn)反應(yīng)體系是否有污染；標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(R2)>0.98；擴(kuò)增效率(E)應(yīng)在0.8～1.2范圍。采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法換算樣品中mRNA含量，再以GAPDH作為內(nèi)參照計(jì)算樣品中mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1左歸丸含藥血清對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響

體積分?jǐn)?shù)為15%的ZG(H、M、L)含藥血清對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的促增殖作用均明顯高于10%和20%的作用。其中，以15%ZG(L)含藥血清作用48 h后對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的促增殖作用最強(qiáng)(P<0.01)，且與control組比較有顯著差異(P<0.05)，與BML組比無(wú)顯著差異。故采用15%ZG(L)含藥血清[以ZG(L)表示]進(jìn)行細(xì)胞干預(yù)實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)圖1～3。

2ERK1/2信號(hào)通路對(duì)左歸丸含藥血清干預(yù)的MC3T3-E1細(xì)胞ALP表達(dá)的影響

細(xì)胞合成的ALP經(jīng)改良鈣鈷法染色，呈棕黑色細(xì)微顆粒，陰性對(duì)照組無(wú)棕黑色顆粒。與control組比，ZG(L)含藥血清作用于MC3T3-E1細(xì)胞14 d后，細(xì)胞密度增大，細(xì)胞突觸多且長(zhǎng)，棕黑色顆粒增多。加入PD98059后，各組與未加組比較，細(xì)胞突觸明顯回縮，棕黑色顆粒沉積減少，見(jiàn)圖4。

圖110%左歸丸含藥血清對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響

圖215%左歸丸含藥血清對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響

圖320%左歸丸含藥血清對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響

Figure 4. Involvement of ERK1/2 in MC3T3-E1 cell ALP production induced by ZG-medicated serum(×200).A：control;B：PD98059 (PD); C：ZG(L);D:ZG(L)+PD; E：BML; F：BML+PD.

圖4ERK1/2信號(hào)通路對(duì)左歸丸含藥血清干預(yù)的MC3T3-E1細(xì)胞ALP表達(dá)的影響

3ERK1/2信號(hào)通路對(duì)左歸丸含藥血清干預(yù)的MC3T3-E1細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)的影響

形成的鈣化結(jié)節(jié)經(jīng)茜素紅染色呈紅色。與control組比，ZG(L)含藥血清作用于MC3T3-E1細(xì)胞14 d后，鈣化結(jié)節(jié)明顯增多。加入PD98059后，各組與未加組比較，鈣化結(jié)節(jié)明顯減少，見(jiàn)圖5。

Figure 5. Involvement of ERK1/2 in MC3T3-E1 cell mineralization induced by ZG-medicated serum(×40).A：control;B：PD; C：ZG(L);D:ZG(L)+PD; E：BML; F：BML+PD.

圖5ERK1/2信號(hào)通路對(duì)左歸丸含藥血清干預(yù)的MC3T3-E1細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)的影響

4ERK1/2信號(hào)通路對(duì)左歸丸含藥血清干預(yù)的MC3T3-E1細(xì)胞ColⅠ和Cbfα1蛋白表達(dá)的影響

與control組比，ZG(L)能明顯促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞ColⅠ和Cbfα1蛋白的表達(dá)(P<0.05)；加入PD98059后，各組較未加PD98059組比較，ColⅠ和Cbfα1蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05)，見(jiàn)圖6、7。

5ERK1/2阻滯劑對(duì)左歸丸含藥血清干預(yù)的MC3T3-E1細(xì)胞TGF-β1、Smad4和Smad2mRNA表達(dá)的影響

與control組比，ZG(L)與BML均能顯著上調(diào)MC3T3-E1細(xì)胞TGF-β1、Smad4和Smad2 mRNA表達(dá)(P<0.05或P<0.01)；加入PD98059后，ZG(L)及BML組較未加PD98059組比較，Smad4和Smad2 mRNA表達(dá)明顯下降(P<0.05)，TGF-β1mRNA表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)，且有顯著差異(P<0.05)，見(jiàn)圖8～10。

圖6ERK1/2信號(hào)通路對(duì)左歸丸含藥血清干預(yù)的MC3T3-E1細(xì)胞Cbfα1蛋白表達(dá)的影響

圖7ERK1/2信號(hào)通路對(duì)左歸丸含藥血清干預(yù)的MC3T3-E1細(xì)胞ColⅠ蛋白表達(dá)的影響

討 論

1左歸丸治療骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制

補(bǔ)腎方左歸丸始載于明·張介賓《景岳全書·新方八陣·補(bǔ)陣》，能滋腎補(bǔ)陰，用于真陰不足證，癥見(jiàn)腰酸膝軟、盜汗、神?？谠?。骨質(zhì)疏松發(fā)病的主要原因是雌激素缺乏引發(fā)OB的骨形成不足和破骨細(xì)胞(osteoclast, OC)的骨吸收亢進(jìn)導(dǎo)致的骨重建失衡[5]。OB不僅決定骨的形成，同時(shí)也調(diào)節(jié)OC對(duì)骨的吸收，是骨代謝的主要功能細(xì)胞，OB增殖和分化在很大程度上決定了最終形成的骨量。趙宏艷等[6]通過(guò)體外“OC+OB+骨片”共培養(yǎng)的方法，觀察大鼠正常組血清、卵巢切除(ovariectomized,OVX)組血清和OVX+左歸丸含藥血清對(duì)共培養(yǎng)體系的影響。其研究結(jié)果顯示，在OVX狀態(tài)下，左歸丸含藥血清對(duì)OC有直接抑制作用，且可通過(guò)OB介導(dǎo)對(duì)OC的抑制作用。吳昆鵬等[7]研究發(fā)現(xiàn)，小分子肽可通過(guò)增加骨保護(hù)素的表達(dá)來(lái)影響骨保護(hù)素/核轉(zhuǎn)錄因子κB受體活化因子配體系統(tǒng)，間接抑制OC的數(shù)量和功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，左歸丸含藥血清能促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖，提高ALP活性，增強(qiáng)細(xì)胞基質(zhì)鈣化，促進(jìn)Cbfα1和ColⅠ蛋白分泌，上調(diào)TGF-β1、Smad4和Smad2 mRNA表達(dá)。由此提示，左歸丸可能是通過(guò)提高TGF-β1、Smad4和Smad2 mRNA水平而治療骨質(zhì)疏松癥。

圖8ERK1/2信號(hào)通路對(duì)左歸丸含藥血清干預(yù)的MC3T3-E1細(xì)胞TGF-β1mRNA表達(dá)的影響

圖9ERK1/2信號(hào)通路對(duì)左歸丸含藥血清干預(yù)的MC3T3-E1細(xì)胞Smad4mRNA表達(dá)的影響

圖10ERK1/2信號(hào)通路對(duì)左歸丸含藥血清干預(yù)的MC3T3-E1細(xì)胞Smad2mRNA表達(dá)的影響

2ERK1/2和TGF-β1/Smads信號(hào)通路在OB中的作用

ERK1/2信號(hào)通路主要參與細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)化和存活等過(guò)程[8]。近年研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β能通過(guò)激活ERK信號(hào)通路在多數(shù)細(xì)胞效應(yīng)中發(fā)揮作用。Okamoto等[9]研究表明，TGF-β1使ERK和Smad磷酸化，從而誘導(dǎo)人腦膜細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達(dá)，從而引發(fā)腦室內(nèi)出血后的心室擴(kuò)張，其中基質(zhì)金屬蛋白酶是水解骨膠原的特異性酶，和組織金屬蛋白酶抑制因子的平衡狀態(tài)調(diào)控著骨基質(zhì)膠原的降解。Cicek等[10]研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β處理的早期應(yīng)答基因通過(guò)抑制MEK/ERK等信號(hào)通路抑制OC生存。Ghayor等[11]揭示，TGF-β通過(guò)激活ERK通路促進(jìn)OB增殖，而這種效應(yīng)還有賴于蛋白激酶C。朱曉峰等[12]研究MC3T3-E1前體成骨細(xì)胞株發(fā)現(xiàn)，淫羊藿素可以通過(guò)雌激素受體激活BMP/Smad信號(hào)通路而促進(jìn)ALP、ColⅠ和骨鈣素的表達(dá)。然而，對(duì)于在OB中ERK與TGF-β/Smads 級(jí)聯(lián)的研究卻少有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，把ERK1/2特異性阻滯劑PD98059加入到左歸丸含藥血清后，MC3T3-E1細(xì)胞的ALP活性降低，鈣化減弱，Cbfα1和ColⅠ蛋白分泌下降，Smad2和Smad4 mRNA表達(dá)下調(diào)，而TGF-β1mRNA表達(dá)卻進(jìn)一步上調(diào)。盡管大量的文獻(xiàn)證實(shí)，Smads是TGF-β唯一的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，但越來(lái)越多的數(shù)據(jù)暗示，獨(dú)立的Smad通路也可能存在[11]。也有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β對(duì)ERK1/2的激活，下調(diào)Smads對(duì)小鼠OB細(xì)胞ALP活性和礦化的誘導(dǎo)[13]。因此，ERK1/2磷酸化水平降低后TGF-β1mRNA表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)的機(jī)制可能是，在左歸丸含藥血清干預(yù)MC3T3-E1細(xì)胞48 h的時(shí)間里，ERK1/2通過(guò)發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用調(diào)控Smad2 mRNA和蛋白表達(dá)，通過(guò)負(fù)反饋環(huán)路調(diào)控TGF-β1mRNA和蛋白表達(dá)；也可能是，ERK1/2能激活TGF-β1/smads通路，ERK1/2通路被阻滯后，Smad2(R-Smads)磷酸化降低，致使游離的TGF-β1增多；也可能是ERK1/2非依賴于TGF-β1而激活Smad2以發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)?？傊?，ERK1/2與TGF-β1/Smads在左歸丸干預(yù)MC3T3-E1細(xì)胞中的具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究，如增加左歸丸干預(yù)的時(shí)點(diǎn)、優(yōu)化培養(yǎng)條件等。

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EffectsofZuoguipill-medicatedserumonproliferationanddifferentiationofMC3T3-E1cellsviaERK/TGF-β/Smadssignalingcascade

HAO Chang-ying1, REN Yan-ling1, LIU Li-ping1, SONG Nan2, WANG Zhi-min3

(1SchoolofBasicMedicine,2theSecondAffiliatedHospital,3theFirstClinicalInstitute,LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shenyang110032,China.E-mail:yanlingren@tom.com)

AIM: To study the effects of Zuogui pill (ZG)-medicated serum on the proliferation and differentiation of MC3T3-E1 cells via ERK/TGF-β/Smads signaling pathway.METHODSUsing Premarin (conjugated estrogens tablets) as a positive control, the SD female rats were fed with high-, medium- or low-dose of ZG suspension. ZG-medicated serum was separated from abdominal aortic blood 7 d after feeding of ZG. MTT assay was applied to test the effect of ZG-medicated serum on the viability of MC3T3-E1 cells. The production of alkaline phosphatase (ALP) was detected by a modified calcium and cobalt dyeing method. The calcified nodules were observed by the method of alizarin red staining. The levels of core binding factor α1 (Cbfα1) and collagen type I (Col I) protein were analyzed by Western blotting. The mRNA expression of TGF-β1, Smad4 and Smad2 was measured by real-time RT-PCR.RESULTSZG-medicated serum promoted the proliferation of MC3T3-E1 cells in a dose-and time-dependent manner. Compared with other groups, treatment with 15% ZG (low dose) for 48 h increased the proliferation of MC3T3-E1 cells significantly. The protein levels of ALP, Cbfα1 and Col I,the calcified nodules, and the mRNA expression of TGF-β1, Smad4 and Smad2 in MC3T3-E1 cells were all significantly increased after treatment with ZG-medicated serum. After the addition of PD98059 (a specific blocker of ERK1/2 signaling pathway), all those were down-regulated except for mRNA expression of TGF-β1.CONCLUSIONZG regulates MC3T3-E1 cell proliferation and differentiation via the intervention of ERK/TGF-β/Smads signaling cascade, which may be one of the mechanisms that ZG effectively prevents and treats osteoporosis.

Zuogui pill; Extracellular signal-regulated kinases Transforming growth factor beta; Smad proteins; MC3T3-E1 cells

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.09.023