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    三種磁珠法提取脫落細(xì)胞DNA的比較

    2017-01-12 05:30:39王華榮廖勤吳世青
    法醫(yī)學(xué)雜志 2016年6期
    關(guān)鍵詞:峰高均衡性檢材

    王華榮,廖勤,吳世青

    (1.滄州市公安局刑警支隊(duì),河北滄州 061000;2.唐山市公安局刑警支隊(duì),河北唐山 063000)

    三種磁珠法提取脫落細(xì)胞DNA的比較

    王華榮1,廖勤2,吳世青1

    (1.滄州市公安局刑警支隊(duì),河北滄州 061000;2.唐山市公安局刑警支隊(duì),河北唐山 063000)

    法醫(yī)遺傳學(xué);DNA;提取法;磁珠法;脫落細(xì)胞

    法醫(yī)DNA鑒定中的脫落細(xì)胞檢材是指含有人體皮膚黏膜脫落上皮細(xì)胞的檢材,是當(dāng)前刑事案件現(xiàn)場最有可能提取到的生物物證。目前關(guān)于脫落細(xì)胞提取純化方法對比的報(bào)道[1-3]較多,但相同提取方法效果橫向比較的研究較少。本研究對IQ磁珠、M48磁珠、PrepFiler磁珠三種常見的磁珠法提取脫落細(xì)胞DNA的檢驗(yàn)效果進(jìn)行比較,為法庭科學(xué)實(shí)踐提供參考依據(jù),現(xiàn)報(bào)道如下。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    50例脫落細(xì)胞類檢材均取自本實(shí)驗(yàn)室2013—2015年檢案積累,包括10枚煙蒂、10個(gè)飲料瓶、10件衣物(含手套、帽子)、10枚汗液指紋膠帶及10例作案工具(手柄)。

    1.2 方法

    1.2.1 前處理

    煙蒂及膠帶上指紋采取剪取法,飲料瓶及作案工具采取擦拭法[4N6FLOQSwabsTM植絨拭子[4](美國AB公司)],衣物采取吸取法[生物脫落細(xì)胞提取儀[5](北京貝斯湃生物技術(shù)有限責(zé)任公司)]。每份樣本平均分配至3個(gè)微量離心管中備檢。

    1.2.2 DNA提取

    IQ磁珠法:使用Maxwell?16自動純化儀(美國Promega公司)按照儀器及IQ磁珠試劑盒(美國Promega公司)相關(guān)說明進(jìn)行DNA抽提。

    M48磁珠法:采用MagAttract M48 DNA Manual試劑盒(德國QIAGEN公司),按照公安部物證鑒定中心IFSC-02-02-05-2010《M48手工提取方法》進(jìn)行DNA抽提。

    PrepFiler磁珠法按照PrepFiler?BTA Forensic DNA Extraction試劑盒(美國AB公司)操作說明書進(jìn)行DNA抽提。

    1.2.3 DNA擴(kuò)增、檢測及分析

    采用AmpFlSTR?Identifiler?Plus試劑盒(美國AB公司)10μL體系(包括緩沖液4μL,超純水3μL,引物2 μL和模板DNA 1 μL),在9700型PCR擴(kuò)增儀(美國AB公司)上按試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用3130xl型遺傳分析儀(美國AB公司)進(jìn)行檢測,GeneMapper ID v3.2軟件分析結(jié)果。

    磁珠提取法檢驗(yàn)成功的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn):樣本所有基因座均能正確分型,獲得的譜峰峰高大于300相對熒光單位(RFU),雜合子兩個(gè)峰高比例在70%以上[6],無或少雜峰等干擾因素。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行多組樣本間的非參數(shù)檢驗(yàn)和組間的兩兩比較,采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)比較各組間的差異,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

    2 結(jié)果與討論

    表1 三種磁珠法提取五類檢材檢驗(yàn)的成功結(jié)果[n=10,例(%)]

    2.1 結(jié)果

    2.1.1 檢驗(yàn)成功率

    五類檢材三種磁珠法提取檢驗(yàn)獲得成功結(jié)果情況見表1。對磁珠法、檢材類型的不同檢驗(yàn)成功率進(jìn)行交互比較,發(fā)現(xiàn)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。三種常見磁珠法脫落細(xì)胞檢驗(yàn)成功率:PrepFiler磁珠法[45例(90%)]>M48磁珠法[43例(86%)]>IQ磁珠法[26例(52%)]。五類檢材脫落細(xì)胞檢驗(yàn)成功率:煙蒂[30例(100%)]>衣物[26例(87%)]>飲料瓶[24例(80%)]>作案工具[18例(60%)]>汗液指紋[16例(53%)]。

    2.1.2 圖譜均衡性及峰高

    五類檢材采用三種磁珠法提取檢驗(yàn)獲得成功結(jié)果的峰高均值和雜合子均衡性見表2。PrepFiler磁珠法與M48磁珠法的峰高及均衡性差異不明顯,但均好于IQ磁珠法。對PrepFiler磁珠法、M48磁珠法與IQ磁珠法的峰高進(jìn)行同一樣本對比,發(fā)現(xiàn)三種方法均檢驗(yàn)成功的樣本中有21例(81%)在PrepFiler磁珠法與M48磁珠法的峰高為IQ磁珠法的1.5~2.5倍。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn),檢測得到的峰高均值越高,雜合子均衡性越好。

    表2 三種磁珠法提取五類檢材獲得的峰高均值和雜合子均衡性(n=10)

    3 討論

    三種磁珠法均利用細(xì)胞裂解液和蛋白酶促使細(xì)胞膜、核膜破裂釋放DNA,通過磁珠作為載體在相關(guān)試劑盒試劑制造的環(huán)境下結(jié)合DNA,利用磁力架(棒)富集磁珠,并洗滌、純化去除干擾雜質(zhì)后,將DNA釋放于體積相對較少、DNA模板濃度較高的洗脫液中。此過程起到提取、純化、富集的作用,因此磁珠法對于污染重、微量的脫落細(xì)胞DNA的提取具有較大優(yōu)勢。

    本研究中,五種不同類型脫落細(xì)胞檢材樣本的檢驗(yàn)除采用不同的磁珠提取方法外,余實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)均保持完全一致,確保無其他可能的因素影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。結(jié)果顯示,對于煙蒂檢材因其含有的模板DNA量較大,三種磁珠法均能獲得理想的效果;對于飲料瓶、衣物類檢材其含有的模板DNA量或多或少,PrepFiler磁珠法與M48磁珠法獲得的圖譜峰高均值更大,檢驗(yàn)成功率更高;對于汗液指紋、作案工具等接觸類檢材其含有的模板DNA量較少,PrepFiler磁珠法與M48磁珠法獲得的檢驗(yàn)成功率更高。以上結(jié)果均表明PrepFiler磁珠法與M48磁珠法對DNA具有更好的吸附或釋放性能,相比IQ磁珠法更適合于脫落細(xì)胞中微量模板DNA的提取檢驗(yàn),在實(shí)際檢案應(yīng)用中更具優(yōu)勢。

    [1]楊電,劉超,徐曲毅,等.DNA IQ磁珠法結(jié)合Maxwell? 16自動儀提取接觸DNA[J].刑事技術(shù),2011,(3):3-5.

    [2]徐程,豐蕾,楊帆,等.微量接觸DNA的濃縮與回收[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45(6):532-535.

    [3]駱繼懷,陳曉軍,孫紅兵,等.接觸性生物檢材提取DNA方法的比較[J].蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2015,41(1):18-22.

    [4]徐海軍,葉志鵬,徐姚力,等.植絨和棉簽拭子對不同載體微量生物物證的提取研究[J].刑事技術(shù),2015,(5):373-375.

    [5]陳殿宇,郝金萍,張忠祥,等.生物脫落細(xì)胞提取儀在案件檢驗(yàn)中的應(yīng)用[J].刑事技術(shù),2008,(2):58-59.

    [6]巴華杰,林子清,劉亞楠,等.5種免提取試劑盒檢驗(yàn)濾紙血痕結(jié)果的比較[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志,2013,28(1):49-51.

    (本文編輯:張素華)

    更正聲明

    各位讀者,2016年第5期《鈍器致鼻部骨折95例法醫(yī)學(xué)分析》一文,有一處筆誤,現(xiàn)更正如下:第355頁“3.5完善鑒定標(biāo)準(zhǔn)的思考和建議”中第一段第四行“上頜骨額突骨折合并鼻中隔骨折按《舊標(biāo)準(zhǔn)》……”,更正為“單純鼻骨骨折(無明顯移位)合并鼻中隔骨折在《舊標(biāo)準(zhǔn)》中并無明確規(guī)定,實(shí)踐中存在爭議”。特此聲明。

    《法醫(yī)學(xué)雜志》編輯部

    DF795.2

    B

    10.3969/j.issn.1004-5619.2016.06.018

    1004-5619(2016)06-0459-02

    2016-06-03)

    王華榮(1966—),男,副主任法醫(yī)師,主要從事法醫(yī)病理學(xué)和法醫(yī)物證學(xué)鑒定與研究;E-mail:wushiqing507@sohu.com

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