流式細(xì)胞術(shù)檢測骨肉瘤中RUNX3和β—catenin的表達(dá)及意義

吳同申　彭圣智　孟彥

[摘要] 目的 檢測骨肉瘤中RUNX3和β-catenin的表達(dá)，探討其關(guān)系及臨床意義，以期為臨床工作提供理論支持。 方法 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測86例骨肉瘤（觀察組）及40例良性骨腫瘤（對照組）中RUNX3和β-catenin的表達(dá)，觀察其在不同臨床特征中的意義，觀察RUNX3和β-catenin的關(guān)系。 結(jié)果 RUNX3和β-catenin在骨肉瘤中的表達(dá)量明顯低于對照組，骨肉瘤中RUNX3和β-catenin的表達(dá)量在不同軟組織浸潤及不同Ennecking分期的比較中，有明顯差別。線性相關(guān)分析顯示骨肉瘤中RUNX3和β-catenin具有正相關(guān)。 結(jié)論 RUNX3和β-catenin在骨肉瘤中表達(dá)異常，兩者可能存在協(xié)同作用，檢測兩種術(shù)后的表達(dá)對判斷預(yù)后有一定價值。

[關(guān)鍵詞] 骨肉瘤；RUNX3；β-catenin；流式細(xì)胞術(shù)

[中圖分類號] R738.1[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A[文章編號] 1673-9701（2012）32-0004-02

骨肉瘤臨床多見，其在發(fā)展過程中可見機(jī)體多種蛋白質(zhì)異常表達(dá)[1]。RUNX3是一種抑癌基因，定位于染色體1p36.1，基因序列高度保守，對細(xì)胞的生長發(fā)育過程發(fā)揮重要作用[2]。β-catenin是黏附家族的一個經(jīng)典成員，是上皮細(xì)胞表面的重要黏附分子[3]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測骨肉瘤中RUNX3和β-catenin的表達(dá)，關(guān)注其臨床價值，旨在為臨床工作提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

收集我院、山東大學(xué)齊魯醫(yī)院、山東大學(xué)第二醫(yī)院經(jīng)病理證實(shí)的骨肉瘤86例新鮮標(biāo)本作為觀察組。納入均經(jīng)病理學(xué)確診，并符合WHO關(guān)于軟組織與骨腫瘤病理學(xué)和遺傳學(xué)的診斷標(biāo)準(zhǔn)。年齡為18～59歲，平均39.08歲，其中男50例，女36例?；颊呤中g(shù)前均未進(jìn)行任何放化療。對照組為同期在我院治療的良性骨腫瘤術(shù)后脫鈣的標(biāo)本40例，骨樣骨瘤20例，骨母細(xì)胞瘤20例，年齡18～56歲，平均38.9歲。兩組在一般臨床特征的比較中，無明顯差別，具有可比性。

1.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測方法

RUNX3和β-catenin試劑均購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。RUNX3和β-catenin的檢測應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)。具體步驟：將脫鈣后的標(biāo)本置于不銹鋼網(wǎng)上，將組織剪成碎屑，然后用鑷子輕搓，生理鹽水同時沖洗，直到組織搓完。收集混懸液，過濾，離心，制成1×106/mL單細(xì)胞懸液，加入抗體后孵育30 min，然后洗滌，撇棄上清液，加入二抗工作液FITC-IgG 100 μL，孵育30 min，加入PBS 10 mL，離心，撇棄上清。加入PBS，過濾后上機(jī)進(jìn)行檢測[4]。流式細(xì)胞儀（美國BC公司生產(chǎn)），免疫熒光數(shù)據(jù)分析應(yīng)用系統(tǒng)自帶軟件進(jìn)行。

1.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RUNX3和β-catenin在觀察組與對照組中的表達(dá)

RUNX3和β-catenin在觀察組與對照組中的表達(dá)量均存在明顯差異，P < 0.05。見表1。

2.2 觀察組中不同臨床特征患者RUNX3和β-catenin的表達(dá)差異

觀察組中RUNX3和β-catenin的表達(dá)與骨肉瘤的軟組織浸潤及Ennecking分期相關(guān)。見表2。

2.3 觀察組中RUNX3和β-catenin表達(dá)的關(guān)系

經(jīng)線性相關(guān)分析，骨肉瘤中RUNX3和β-catenin的表達(dá)呈正相關(guān)（r = 0.45，P = 0.034 2 < 0.05）。

2.4 觀察組中RUNX3和β-catenin的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

觀察組患者隨訪時間為8～48個月，平均28.2個月，觀察組中RUNX3和β-catenin的表達(dá)與預(yù)后相關(guān)（P < 0.05），即RUNX3和β-catenin低表達(dá)的患者預(yù)后差。

3 討論

骨肉瘤是臨床常見，細(xì)胞連接和細(xì)胞外基質(zhì)多存在異常。控制RUNX3基因轉(zhuǎn)錄的是P1和P2啟動子，這兩個啟動子結(jié)構(gòu)不同。P2在外顯子2之前，周圍有一個CpG島，富含GC啟動子的特征，是一個高度保守區(qū)。RUNX3與腫瘤的發(fā)展有密切關(guān)系，是一個抑癌基因，抑癌的機(jī)制尚不十分清楚[5]。RUNX3對消化道上皮細(xì)胞的生長具有重要的調(diào)控作用，能抵抗TGF-β誘導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制和細(xì)胞凋亡，從而調(diào)控上皮細(xì)胞的分化過程[6]。而當(dāng)RUNX3 失活時，影響TGF-β凋亡信號的傳導(dǎo)，阻滯正常的凋亡過程，正常細(xì)胞的增殖不受限制，出現(xiàn)細(xì)胞惡變。β-catenin是黏附家族的成員，與其他黏附家族成員一起與E-cadherin結(jié)合，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞及上皮細(xì)胞的黏附，抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。既往對β-catenin細(xì)胞黏附方面的作用研究較多[7]，但是在正常分化成熟的細(xì)胞中，β-catenin通過與膜表面的E-cadherin結(jié)合參與同質(zhì)性黏附。當(dāng)β-catenin降解障礙時，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)β-catenin水平升高，引起β-catenin大量聚集進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合啟動下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[8，9]。

本實(shí)驗(yàn)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測骨肉瘤中RUNX3和β-catenin的表達(dá)特點(diǎn)，結(jié)果顯示骨肉瘤中RUNX3和β-catenin的表達(dá)量明顯低于對照組，提示RUNX3和β-catenin表達(dá)的丟失在腫瘤進(jìn)展中起重要作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，觀察組中RUNX3和β-catenin的表達(dá)量均與有、無軟組織浸潤及Ennecking的分期有關(guān)，由于骨肉瘤中軟組織浸潤及Ennecking分期均與患者的預(yù)后密切相關(guān)，因此術(shù)后對骨肉瘤患者行RUNX3和β-catenin的流式細(xì)胞術(shù)檢測，可能對判斷患者預(yù)后有一定價值，即RUNX3和β-catenin低表達(dá)患者的預(yù)后差，本實(shí)驗(yàn)生存分析也直接證實(shí)了二者在腫瘤中預(yù)后的判斷價值。侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤生物學(xué)行為的重要標(biāo)志，是導(dǎo)致死亡和影響預(yù)后的主要原因之一。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示骨肉瘤中RUNX3和β-catenin的表達(dá)呈正相關(guān)，提示RUNX3和β-catenin可能有正向協(xié)同效應(yīng)，即RUNX3和β-catenin可能具有通路作用，即RUNX3和β-catenin協(xié)同作用時，參與腫瘤細(xì)胞外細(xì)胞連接的改變，共同促進(jìn)腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移，但是具體的詳細(xì)調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚，有待更多基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

總之，流式細(xì)胞術(shù)檢測RUNX3和β-catenin在骨肉瘤中低表達(dá)，二者可能具有協(xié)同作用，術(shù)后應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測RUNX3和β-catenin的表達(dá)可能對判斷預(yù)后有一定價值。

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（收稿日期：2011-11-22）