遺傳性小耳畸形家系FGF3基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)及意義

劉嘉鋒,孫家明,李小丹

[摘要]目的：探討遺傳性小耳畸形家系FGF3基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài)及意義。方法：應(yīng)用甲基化特異性PCR（MSP）法檢測(cè)遺傳性小耳畸形患者及其直系親屬的FGF3基因啟動(dòng)子甲基化32例，同時(shí)以20例健康者為對(duì)照。結(jié)果：遺傳性小耳畸形患者及直系親屬FGF3基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)明顯低于對(duì)照組，且有顯著性差異（P<0.01）。遺傳性小耳畸形家系組中，患病者的基因甲基化程度小于耳廓正常者（P<0.05）.結(jié)論：FGF3基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)可能與遺傳性小耳畸形的發(fā)生有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]先天性小耳畸形家族；FGF3基因；甲基化

[中圖分類號(hào)]R764.7[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2012）04-0611-02

Study of methylation of promoter of FGF3 gene in genetic microtia pedigree

LIU Jia-feng,SUN Jia-ming,LI Xiao-dan

(The department of plastic and reconstruction, Union hospital ,Tongji medical college, Huazhong science &technique university,Wuhan 430022,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the methylation in promoter of FGF3 gene in genetic microfia pedigree.MethodsThe methylation in FGF3 gene in 32 people of genetic microtia pedigree and 20 healthy controls were measured using Methylation-specific PCR(MSP).ResultsThe methylation of FGF3 gene in microtia were significantly lower than those in control(P<0.01).In the genetic microtia pedigree,the methylation of FGF3 gene in the patients were significantly lower than those in the healthy people(P<0.05).ConclusionsHypomethylation of FGF3 gene may related to the pathogenesis of genetic microtia．

Key words:Genetic mierotia pedigree;FGF3 gene;Methylation

小耳畸形是常見(jiàn)的先天性疾病，對(duì)其基因?qū)W的研究雖有一定的定位，然而，目前仍未明確某個(gè)基因的改變必然引起小耳畸形的發(fā)生。FGF3是脊椎動(dòng)物頭部軟骨形成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，F(xiàn)GF3及FGFR2基因的突變可能導(dǎo)致在胚胎時(shí)期軟骨細(xì)胞分化及遷移的障礙，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)一家系FGF3基因上存在三個(gè)純合子突變，并認(rèn)為該突變與內(nèi)耳發(fā)育不良及小耳畸形有密切相關(guān)[1]，而FGF3基因啟動(dòng)子甲基化狀體及其在遺傳性小耳畸形發(fā)生中的作用至今仍未見(jiàn)報(bào)道，本文擬通過(guò)對(duì)遺傳性小耳畸形家系的研究，了解家系成員中FGF3基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)及其在小耳畸形發(fā)生中的作用。

1資料和方法

1.1 研究對(duì)象：選取2007年7月～2011年7月在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院整形外科就診的遺傳性小耳畸形家系4個(gè)，選其健在的直系親屬32人進(jìn)行研究，其中男性19人，女性13人，年齡5～57歲。選擇同期就診的耳廓正常、無(wú)其他先天性畸形家族史的患者20例為對(duì)照。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)本采集及DNA提?。撼槿山M病例空腹靜脈血6ml,4℃保存?zhèn)溆?，血?biāo)本收集完成后，提取血樣中的DNA，用分光光度計(jì)定量，瓊脂糖凝膠電泳質(zhì)檢。質(zhì)檢合格的DNA將濃度調(diào)整后，置-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 亞硫酸氫鈉處理基因組DNA：參照甲基化特異性PCR方法，用亞硫酸氫鈉處理基因組DNA，用2.5倍體積預(yù)冷無(wú)水乙醇和2μl糖原沉淀DNA，-40℃ 過(guò)夜；然后用70%乙醇洗滌沉淀2次，干燥后用30μl去離子水溶解，-4O℃ 保存。

1.2.3 甲基化特異性PCR：設(shè)計(jì)FGF3基因甲基化引物正義鏈和反義鏈，非甲基化引物的正義鏈及反義鏈。總體積為30μl反應(yīng)液中含DNA 5μl，10×緩沖液3μl，MgCl22.5mmol/L，引物0.5μmol/L，dNTP250μmol/L，Hotstar Taq 0.5μl。MSP反應(yīng)條件：95℃,15min，95℃, 30 S，60℃ 30s，72℃ 30s，35個(gè)循環(huán)，72℃ 延伸10min。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS11.5軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，血漿FGF基因甲基化分析采用χ2檢驗(yàn)，P≤O.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組血漿FGF3基因甲基化程度明顯小于對(duì)照組（P<0.01）,實(shí)驗(yàn)組中，患病者的基因甲基化程度小于耳廓正常者（P<0.05）。

3討論

3.1 先天性小耳畸形是常見(jiàn)的先天性疾病，其發(fā)病率較高，約1/7 000[2],它主要因?yàn)榕咛r(shí)期第一鰓溝及其鄰近的第1、2鰓弓的發(fā)育異常引起的一組頜面畸形，主要表現(xiàn)為外耳及中耳的異常，傳導(dǎo)性或混合性耳聾，有時(shí)伴有耳前凹陷或副耳[3-4]。其病因尚不明確，環(huán)境和遺傳是重要發(fā)病因素，遺傳因素雖不是小耳畸形的主要致病因素，但目前家族遺傳性小耳畸形的報(bào)道并不鮮見(jiàn)[5-6]，基因改變?cè)谛《伟l(fā)生中的作用受到學(xué)者們的廣泛重視。

3.2 傳統(tǒng)的基因突變是指存在DNA序列改變的可遺傳的基因表達(dá)的改變，但是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)以DNA甲基化、組蛋白修飾[7]及染色質(zhì)重塑等為主的沒(méi)有DNA序列變化的改變，可產(chǎn)生可以遺傳的基因表達(dá)改變，統(tǒng)稱為表觀遺傳學(xué)改變。DNA甲基化是指CpG二核苷酸中的胞嘧啶第5位碳原子被甲基化，在DNA序列不變的情況下，控制基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)DNA重組及某些特定基因組區(qū)域的轉(zhuǎn)錄活性。DNA的甲基化狀態(tài)改變作為一個(gè)表觀的標(biāo)簽，易于受激素、飲食以及藥物等外界因素的可逆的修飾，標(biāo)示出該基因是沉默或表達(dá)。當(dāng)甲基化程度越高，基因就越“沉默”，反之亦然。在腫瘤疾病中DNA甲基化改變表現(xiàn)為整個(gè)基因組低甲基化、局部基因高甲基化[8]。潘博等[9]前期研究未發(fā)現(xiàn)小耳畸形患者中存在EYA1基因突變位點(diǎn)，林琳[10]等對(duì)該基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)存部分區(qū)域的低甲基化，并推測(cè)可能與小耳畸形的發(fā)病有關(guān)。

3.3 FGF3是脊椎動(dòng)物頭部軟骨形成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[11]；而在胚胎肢體發(fā)育中，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（FGFRs）在由干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化中發(fā)揮重要的作用。Hellingman等[12]認(rèn)為FGFR2在人間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨誘導(dǎo)分化的第一期，即間質(zhì)凝集期有明顯的表達(dá)，表明FGF3及其受體信號(hào)途徑在軟骨發(fā)生過(guò)程中起重要的作用。FGF3及FGFR2基因的突變，可能導(dǎo)致在胚胎時(shí)期軟骨細(xì)胞分化及遷移的障礙。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)FGF3上存在的三個(gè)純合子突變（p.S156P，p.R104X，及p.V206SfsX117）與以內(nèi)耳發(fā)育不全、小耳及小牙癥為表征的綜合征性耳聾有密切相關(guān)[1]；目前雖尚未見(jiàn)小耳畸形患者中存在FGF3基因甲基化改變的相關(guān)報(bào)道，對(duì)于其基因甲基化狀態(tài)的研究將進(jìn)一步解釋FGF3基因與小耳畸形發(fā)生的關(guān)系。

3.4 筆者的研究發(fā)現(xiàn)在FGF3基因啟動(dòng)子上存在低甲基化狀態(tài)，提示可能與小耳畸形的發(fā)生有關(guān)，其機(jī)制可能是因?yàn)镕GF3基因具有基因劑量效應(yīng)，即劑量達(dá)到一定閾值基因才能發(fā)揮正常功能，所以同一家系不同成員中存在外顯不全或表觀度變異。此外，基因低甲基化也可能引起患側(cè)組織染色體重構(gòu)，并進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞表型的變化。進(jìn)一步的研究將詳細(xì)了解哪些具體位點(diǎn)的甲基化改變，以及FGF3整體的低甲基化改變對(duì)基因表達(dá)及耳軟骨細(xì)胞發(fā)生及遷移的影響。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Tekin M,Hi?mi BO,Fitoz S,et al.Homozygous mutations in fibroblast growth factor 3 are associated with a new form of syndromic deafness characterized by inner ear agenesis,microtia,and microdontia[J].Am J Hum Genet,2007,80(2):338-344.

[2]朱軍,王艷萍,梁娟,等.1988-1992全國(guó)先天性無(wú)耳及小耳畸形發(fā)病率的抽樣調(diào)查[J].中華耳鼻咽喉科雜志,2000,35(1):62-65.

[3]莊洪興,蔣海越,潘博,等.先天性小耳畸形的皮膚軟組織擴(kuò)張器法外耳再造術(shù)[J].中華整形外科雜志，2006，22(4)：286-289．

[4]Pan B,Jiang It,Guo D,et a1.Microtia:ear reconstruction use tissue expander and autogenous costal cartilage[J].J Plast Reconstr Aesthet Surg,2008,61(Suppl 1):S98-S103.

[5]Alasti F,Sadeghi A,Sanati MH,et al. A Mutation in HOXA2 Is Responsible for Autosomal-RecessiveMicrotia in an Iranian Family[J].Am J Hum Genet,2008,82(4):982-991.

[6]Zhang Q,Zhang J,Yin W.Environmental and genetic factors associated with congenital microtia:a case-control study in Jiangsu,China,2004 to 2007[J].Plast Reconstr Surg, 2009,124(4):1157-1164.

[7]Aoyama T,Okamoto T,Fukiage K,et al.Histone modifiers,YY1 and p300,regulate the expression of cartilage-specific gene,chondromodulin-I,in mesenchymal stem cells[J].J Biol Chem, 2010,285(39):29842-29850.

[8]陸嶸,房靜遠(yuǎn).表觀遺傳修飾和腫瘤[J].生命科學(xué)，2006，18(1)：10-14．

[9]潘博,林琳,蔣海越,等.先天性小耳畸形家系收集及遺傳學(xué)研究[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)美容,2007,16(8):1023-1026.

[10]林琳,潘博,蔣海越,等.先天性小耳畸形EYA1基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化初步研究[J].中華整形外科雜志,2009,25(6):436-439.

[11]Walshe J,Mason I.Fgf signalling is required for formation of cartilage in the head[J].Dev Biol,2003,264(2):522-536.

[12]Hellingman CA,Koevoet W,Kops N,et al.Fibroblast growth factor receptors in in vitro and in vivo chondrogenesis:relating tissue engineering using adult mesenchymal stem cells to embryonic development[J].Tissue Eng Part A,2010,16(2):545-556.

[收稿日期]2011-12-15 [修回日期]2012-02-19

編輯/張惠娟