異體復(fù)合組織移植皮膚淋巴引流隔絕動(dòng)物模型的建立

劉沙,裴蛟淼,李楊,曹姣,楊陽(yáng),李冰,夏煒,郭樹(shù)忠

[摘要]目的：通過(guò)SD大鼠下腹部游離皮瓣及皮管的移植，建立大鼠異體復(fù)合組織移植皮膚淋巴引流隔絕模型。方法：7～8周齡雄性SD大鼠切取下腹部皮瓣并游離行同種異體移植，皮膚隔離組（A組）：將供體皮瓣邊緣對(duì)合、縫合成管狀，底邊留血管蒂出口用隔離器隔離皮膚，顯微外科吻合血管，皮管縫合于隔離器，隔離器固定于受體；皮膚未隔離組（B組）：將供體游離皮瓣卷制成管狀，顯微外科吻合血管并將供受體皮膚對(duì)位縫合；空白對(duì)照組（C組）：行下腹部游離皮瓣異體移植。大體觀察每組皮瓣或皮管存活時(shí)間，于術(shù)后3、5、7、14、28、35d取移植物皮膚組織行HE染色,觀察病理學(xué)變化。結(jié)果：A組：皮管存活時(shí)間為32（34，32）天；B組：皮管存活時(shí)間為15（16,15）天；C組：皮瓣存活時(shí)間為6（7,6）天。A組與C組、B組與C組、A組與B組存活率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)成功建立了大鼠的異體復(fù)合組織移植淋巴引流隔絕模型,并證實(shí)了隔絕皮膚淋巴引流能有效延長(zhǎng)移植物的存活時(shí)間。

[關(guān)鍵詞]異體復(fù)合組織移植；免疫抑制；動(dòng)物模型；淋巴引流

[中圖分類號(hào)]R332[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2012）04-0589-04

The establishing of composite tissue allograft skin lymphatic vessels isolation animal model in rats

LIU Sha,PEI Jiao-miao,LI Yang, CAO Jiao,YANG Yang，LI Bing，XIA Wei, GUO Shu-zhong

(Institute of Plastic Surgery, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, Shaanxi,China)

Abstract:ObjectiveTo establish lymphatic vessels isolation animal model through vascularized hypogastric flap between SD rats.Methods18 couples of SD rats(7-8weeks) were randomly divided into 3 groups. Group A(skin lymphatic vessles isolation): The free tube made of vascularized free flap located on the surface of the recipient through the isolation device after vascular anastomosis. Group B(tube) : The free tube made of vascularized free flap sutured on the recipient lower abdomen directly after vascular anastomosis. Group C(control) free flap allotransplantation. Observe the survive ratio of animal and rejection time of composite tissue flap, histologic outcomes on the day 3,5,7,14,28, and 35 after transplantation. ResultsThe survival times of grafts in group A are 32（34, 32）days and group B were 15（16,15）days. By contrast,the survival time of group C was 6（7,6）days. The difference among these three groups were significant. ConclusionsThis experiment successfully established lymphatic vessels isolation animal model in SD rats. The prolonged survival times of the grafts in this animal model had been proved.

Key words: composite tissue allotransplantation；immunosuppression；animal model; lymph draining

器官移植已成功應(yīng)用于臨床50多年，然而異體復(fù)合組織移植卻仍處于研究階段，難以在臨床上推廣應(yīng)用。皮膚的強(qiáng)抗原性和缺少有效安全的免疫抑制方案成為限制異體復(fù)合組織移植發(fā)展的主要因素[1-2]。探索皮膚強(qiáng)抗原性的機(jī)制，并通過(guò)尋找靶點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)，來(lái)降低機(jī)體對(duì)異體皮膚移植物的免疫排斥成為研究熱點(diǎn)[2]。血液循環(huán)系統(tǒng)及淋巴引流系統(tǒng)是機(jī)體排斥同種異體移植物的重要組織結(jié)構(gòu)，然而哪個(gè)更為重要仍存在爭(zhēng)議[3]。在異體皮膚及角膜的移植研究中，證實(shí)引流淋巴結(jié)及淋巴引流至關(guān)重要，對(duì)切除引流淋巴結(jié)的豚鼠進(jìn)行相應(yīng)引流部位的異體皮膚移植后，異體皮膚存活時(shí)間延長(zhǎng)[4]，角膜的Langerhans等骨髓來(lái)源的細(xì)胞[5-6]在移植后可以遷移至局部引流淋巴結(jié)，提呈角膜的異體抗原，引發(fā)免疫排斥反應(yīng)[7]，因此阻斷異體復(fù)合組織移植物的皮膚淋巴引流與受體相接觸，有效的切斷移植物中的抗原提呈細(xì)胞通過(guò)淋巴管引流至引流淋巴結(jié)，從而阻止其激活T細(xì)胞，無(wú)法啟動(dòng)免疫排斥反應(yīng)，進(jìn)而可能誘導(dǎo)免疫耐受，延長(zhǎng)移植物的存活時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)擬建立大鼠下腹部異體復(fù)合組織移植皮膚淋巴引流隔絕模型，該模型的異體移植物僅有血液循環(huán)系統(tǒng)而無(wú)淋巴引流系統(tǒng)，通過(guò)觀察移植物的存活情況來(lái)評(píng)估淋巴引流系統(tǒng)對(duì)啟動(dòng)移植排斥的重要性。

1材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組：隨機(jī)選取清潔級(jí)體重280～300g SD雄性大鼠36只（供受體各18只），由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；實(shí)驗(yàn)分組：隨機(jī)分為3組，A組（淋巴隔離組，n=6）：將供體皮瓣邊緣對(duì)合后縫合為管狀并用隔離器隔離，顯微外科吻合血管，皮管縫合固定于隔離器內(nèi)，隔離器縫合固定于受體；B組（淋巴未隔離組，n=6）：將供體游離皮瓣邊緣對(duì)合后縫合為管狀，顯微外科吻合血管并將皮管直接縫合于受體；C組（對(duì)照組，n=6）：行下腹部游離皮瓣異體移植。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備與材料：手術(shù)顯微鏡（Leica M651）,顯微手術(shù)器械（上海眾合天工醫(yī)療器械有限公司），自制隔離器，甲醛(天津天峰化學(xué)藥品有限公司)，戊巴比妥鈉（佛山市實(shí)驗(yàn)化工廠），顯微鏡（Nikon Eclipse 55i）。

1.3 動(dòng)物模型的建立

1.3.1 隔離器的制作：選取直徑為3.5cm高2cm的圓形塑料蓋子，在塑料蓋側(cè)邊和內(nèi)緣處標(biāo)記六個(gè)等分點(diǎn)，在標(biāo)記處打直徑約3mm圓孔，在側(cè)邊各圓孔連線中點(diǎn)用鋼鋸切割至內(nèi)緣處，消毒滅菌（見(jiàn)圖1、2）。

1.3.2 隔絕動(dòng)物模型的制作

1.3.2.1供體手術(shù)：戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，劑量為50mg/kg，術(shù)中必要時(shí)追加1/3量。剃除下腹及后肢毛發(fā)，消毒、鋪單后在股動(dòng)脈搏動(dòng)點(diǎn)上方設(shè)計(jì)一大小為4cm×4cm的皮瓣，切開(kāi)皮膚及皮下肉膜層，暴露出股動(dòng)靜脈血管束及其分支腹壁淺動(dòng)靜脈，皮瓣四周游離后折疊成皮管并縫合皮膚，給血管蒂入口留出足夠空間避免血管蒂受壓。顯微鏡下游離出大鼠股動(dòng)靜脈，結(jié)扎其分支并仔細(xì)剝除血管旁膜以備吻合血管，于腹壁淺動(dòng)靜脈分支處結(jié)扎股動(dòng)靜脈分支，血管夾分別夾閉股動(dòng)靜脈，顯微剪在股動(dòng)靜脈已剝除血管旁膜部位剪斷血管，游離皮管肝素化。

1.3.2.2 受體手術(shù)：麻醉、消毒、鋪單同供體，在腹股溝處標(biāo)記一三角形區(qū)域，切開(kāi)皮膚及皮下組織，充分暴露股動(dòng)靜脈，顯微鏡下分離并剝除待吻合處血管外膜，遠(yuǎn)端11-0尼龍線結(jié)扎，近端血管夾夾閉，顯微剪于待吻合處剪斷血管，肝素沖洗待吻合血管。

1.3.2.3 吻合手術(shù)：將皮管原位置于受區(qū)，11-0尼龍線吻合動(dòng)靜脈。

1.3.2.4 安裝隔離器：血管吻合完畢后，將皮管放置于已消毒的隔離器中，血管蒂通過(guò)隔離器內(nèi)孔并且不受周圍組織及隔離裝置的擠壓，將皮管通過(guò)內(nèi)緣圓孔用1號(hào)線縫合于隔離器上，將縫線收緊并打結(jié)，使供瓣皮緣僅與隔離器接觸，同時(shí)隔離器也通過(guò)內(nèi)緣圓孔縫合固定于受鼠體表,受鼠皮緣也僅與隔離器接觸，使得皮管以類似于帳篷樣支撐于隔離器上，供、受體之間僅通過(guò)血管蒂連接，從而將移植物通過(guò)隔離器牢靠地固定于受區(qū)并保證雙方皮膚不發(fā)生接觸。將細(xì)鐵絲網(wǎng)按隔離器外緣大小剪成圓形，邊緣用醫(yī)用膠布粘貼，并將其通過(guò)固定器的側(cè)邊圓孔1號(hào)線固定（見(jiàn)圖1）。此步驟目的在于保證移植物皮膚不與受體接觸的前提下血管蒂不受擠壓，皮瓣不被受體鼠啃咬。

1.4觀察及檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 觀察皮瓣的大體生存情況及存活天數(shù)，皮膚色澤、質(zhì)地、有無(wú)滲出，并做記錄，繪制生存曲線。

1.4.2 病理切片觀察：術(shù)后第3、5、7、14、28、35天取移植物皮膚組織1cm2，即刻浸泡于10%甲醛溶液24h，石蠟包埋、切片，HE染色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均在統(tǒng)計(jì)教研室的指導(dǎo)下，應(yīng)用spss16.0統(tǒng)計(jì)軟件完成。繪制Kaplan-Meier生存曲線，各組生存時(shí)間用中位數(shù)（M）和四分位數(shù)（Q25，Q75）表示，采用Log Rank對(duì)各組生存曲線分布是否相同進(jìn)行檢驗(yàn)，P＜0.05，各組存活天數(shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 隔離裝置：所制淋巴隔離器能夠有效的阻止供體皮瓣與受體皮膚之間的淋巴引流網(wǎng)形成，并且保護(hù)了血管蒂不受擠壓，而且將移植皮瓣固定于受體大鼠下腹部的同時(shí)能夠避免被啃食或拖拽發(fā)生壞死（見(jiàn)圖2）。

2.2 各組移植物的生存情況及生存曲線：各組存活情況見(jiàn)圖3～5。A組皮管的存活時(shí)間分別為33、32、30、38、35、34天；B組皮管的存活時(shí)間分別為14、14、16、15、15、17天；C組皮瓣的生存時(shí)間分別為5、6、6、7、8、7天。

各組生存時(shí)間中位數(shù)與四分位數(shù)值分別為：A組32（34,32），B組15（16,15），C組6（7,6），生存曲線見(jiàn)圖6。

2.3 各組移植物HE染色結(jié)果：術(shù)后第7、14、35天染色結(jié)果分別見(jiàn)圖7～9。

3討論

3.1 同種異體復(fù)合組織移植的應(yīng)用為整形與重建外科移植領(lǐng)域的發(fā)展提供了非常廣闊的空間，解決了以往拆東墻補(bǔ)西強(qiáng)的弊端[8]，雖然顯微手術(shù)技術(shù)方面已趨于成熟，各種新型治療方法如細(xì)胞治療[9]、單克隆抗體干預(yù)[9-11]、誘導(dǎo)嵌合體耐受[12]等手段不斷問(wèn)世，但臨床上仍以免疫抑制藥物為主，其預(yù)防性用藥以及發(fā)生排斥反應(yīng)時(shí)的大劑量沖擊治療所帶來(lái)的毒副作用給患者帶來(lái)了很大的痛苦，不僅經(jīng)濟(jì)上付出沉重的代價(jià)，更面臨發(fā)生危及生命并發(fā)癥的可能。本實(shí)驗(yàn)的目的在于通過(guò)建立皮膚淋巴隔絕的異體復(fù)合組織移植動(dòng)物模型，來(lái)驗(yàn)證淋巴引流系統(tǒng)在異體復(fù)合組織移植中對(duì)啟動(dòng)排斥反應(yīng)的重要性，為進(jìn)一步研究淋巴引流系統(tǒng)啟動(dòng)排斥反應(yīng)的作用機(jī)制提供方法、建立研究基礎(chǔ)。

3.2 皮膚真皮層及真皮下層含有廣泛且豐富的淋巴引流網(wǎng)，這可能是導(dǎo)致人體皮膚免疫原性最強(qiáng)的重要因素，并且真皮下淋巴網(wǎng)具有很強(qiáng)的重建能力[4]。異體復(fù)合組織移植后供受體之間淋巴引流的重建可能是啟動(dòng)免疫排斥反應(yīng)的主要原因。因此，本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新點(diǎn)在于成功建立了同種異體復(fù)合組織移植的皮膚淋巴引流隔絕大鼠模型，在不使用任何免疫抑制藥物的情況下有效延長(zhǎng)了移植物的存活時(shí)間，驗(yàn)證了隔絕皮膚淋巴引流可以有效的阻止或延緩排斥反應(yīng)的發(fā)生。隔絕淋巴組移植物最終發(fā)生了排斥，排斥發(fā)生時(shí)均可以發(fā)現(xiàn)供受體皮膚通過(guò)不斷生長(zhǎng)已發(fā)生接觸，因此排斥的發(fā)生可能是因?yàn)槠つw最終發(fā)生接觸后，重建了淋巴引流，啟動(dòng)了排斥反應(yīng)。下一步的研究應(yīng)設(shè)法持續(xù)阻斷供受體皮膚的接觸，觀察是否能繼續(xù)維持免疫耐受狀態(tài)，并檢測(cè)參與細(xì)胞的不同，分析、比較淋巴管重建前后大鼠免疫狀態(tài)的區(qū)別以及排斥反應(yīng)發(fā)生情況。

3.3 本實(shí)驗(yàn)淋巴隔絕組皮瓣存活超過(guò)30天后，供體皮瓣血管蒂出口處和受體下腹部供體血管蒂入口處的表皮攣縮并向心性生長(zhǎng)，可能導(dǎo)致血管蒂受壓使皮瓣缺血性壞死，在后期研究中需進(jìn)一步驗(yàn)證。在動(dòng)物模型的建立中我們還發(fā)現(xiàn)，在保證供、受體之間皮膚不接觸的同時(shí)避免感染是一個(gè)難題，避免感染一方面要做到嚴(yán)格的無(wú)菌操作，另一方面就是盡可能的縮小血管蒂部的開(kāi)口，但是血管蒂部位的開(kāi)口又不可以太小，否則在術(shù)后皮瓣的腫脹期中會(huì)導(dǎo)致血管受壓發(fā)生血供障礙致移植物壞死，避免感染與保證血管蒂不受擠壓之間尋求平衡是此動(dòng)物模型成功與否的關(guān)鍵。

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[收稿日期]2011-12-26 [修回日期]2012-02-13

編輯/張惠娟