乙酰水楊酸在UVB誘導(dǎo)黑素細(xì)胞樹突形態(tài)相關(guān)分子Rac1和RhoA表達(dá)中的作用

惠坤,簡(jiǎn)強(qiáng),薛柯,朱東寧,安慶,李承新

[摘要]目的：探討乙酰水楊酸（acetylsalicylic acidASA）在UVB誘導(dǎo)黑素細(xì)胞樹突形態(tài)相關(guān)分子Rac1和RhoA表達(dá)中的作用。方法：培養(yǎng)正常人表皮黑素細(xì)胞系PIG1細(xì)胞，將細(xì)胞以一定密度接種于平皿中，并隨機(jī)分為三組，對(duì)照組、100mJ UVB照射組及UVB照射后ASA處理組。ASA處理24h后采用RT-PCR 檢測(cè)Rac1和RhoA mRNA表達(dá)的變化及Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果：PIG1細(xì)胞經(jīng)100mJ UVB照射后與對(duì)照組相比，促進(jìn)樹突形成的Rac1表達(dá)較對(duì)照組明顯增高，而抑制樹突形成的RhoA表達(dá)下調(diào)；ASA處理可反轉(zhuǎn)UVB照射對(duì)Rac1和RhoA的作用， Rac1表達(dá)較UVB照射組明顯降低，而RhoA表達(dá)增高。結(jié)論：一定劑量UVB照射后，黑素細(xì)胞Rac1表達(dá)增高，RhoA表達(dá)下調(diào)；ASA可以抑制一定劑量UVB照射誘導(dǎo)的黑素細(xì)胞樹突形態(tài)相關(guān)分子的改變。

[關(guān)鍵詞]黑素細(xì)胞；UVB照射；ASA；樹突；Rac1；RhoA

[中圖分類號(hào)]Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2012）04-0587-03

Effect of ASA on the expression of the dendrites regulating factors Rac1 and RhoA in melanocytes induced by UVB irradiation

HUI Kun,JIAN Qiang,XUE Ke,ZHU Dong-ning,AN Qing,LI Cheng-xin

(Institute of Dermatology,Xijing Hospital,the Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,Shaanxi,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of acetylsalicylic acid (ASA )on the expression of the dendrites regulating factors Rac1 and RhoA in melanocytes induced by UVB Irradiation.MethodsMelanocytes cultured in plates were divided into 3 groups, control group, 100mJ UVB irradiation group and UVB irradiation plus ASA treatment group, respectively.The mRNA expression of Rac1 and RhoA was analysed with real time RT-PCR, and protein expression was assayed by western blotting.ResultsCompared with control group, UVB irradiation enhanced the protein and mRNA expression of Rac1,while decreased the expression of RhoA. However, ASA treatment could inhibit the influence of UVB irradiation on the Rac1 and RhoA. The protein and mRNA expression of Rac1was decreased obviously and expression of RhoA was enhanced after treatment with ASA.ConclusionsUVB irradiation can increase the expression of Rac1 and decrease the expression of RhoA in melanocytes and ASA can suppress these change induced by UVB irradiation.

Key words:melanocyte;UVB irradiation;ASA;Rac1;RhoA;dendrites

色素沉著的過程十分復(fù)雜，其中黑素的合成與轉(zhuǎn)運(yùn)是最為重要的兩個(gè)環(huán)節(jié)。UVB照射不僅能夠增加黑素合成，本課題組先前的實(shí)驗(yàn)證明其還可以明顯促進(jìn)黑素小體的轉(zhuǎn)移及轉(zhuǎn)運(yùn)。目前有研究表明，乙酰水楊酸（acetyl salicylic acid，ASA）具有淡化色斑的作用，但ASA是否能夠影響UVB誘導(dǎo)的黑素小體的轉(zhuǎn)運(yùn)尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ASA對(duì)UVB誘導(dǎo)黑素細(xì)胞樹突形態(tài)相關(guān)分子的影響，探討ASA在黑素小體轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用。

1材料和方法

1.1材料：永生化的人表皮黑素細(xì)胞系PIG1來自美國艾利諾斯州Loyola醫(yī)學(xué)中心，254培養(yǎng)基、HMGS添加劑（Cascade Biologics公司），標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清、Trizol核酸提取液（GibcoBRL），ASA、胰蛋白酶（Sigma公司），RT-PCR試劑盒（Takara公司），BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒（Pierce公司），兔抗人Rac1單抗、鼠抗人RhoA單抗（abcam公司），山羊抗鼠二抗（HRP）（北京中山生物技術(shù)有限公司），紫外線光療儀（上海希格瑪公司），輻照度以UVB輻照度監(jiān)示器標(biāo)定，UVB劑量=UVB輻照度×?xí)r間(s)，均為單次照射。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組：取對(duì)數(shù)生長期的PIG1細(xì)胞消化后以5×105/ml的密度接種于直徑6mm的平皿，隨機(jī)分為三組：第一組為對(duì)照組，第二組為100mJ UVB照射組，第三組為100mJ UVB照射后即刻給予ASA處理組。具體過程如下：細(xì)胞培養(yǎng)至80%融合時(shí)吸出254培養(yǎng)液，PBS清洗后，再加入1ml PBS后給予UVB照射，吸出PBS，加入原培養(yǎng)液，第三組原培養(yǎng)液中加入ASA使其濃度為100μM，繼續(xù)培養(yǎng)24h。

1.2.2 MTT法測(cè)定生長曲線：取接受不同濃度ASA處理后的PIG1細(xì)胞進(jìn)行MTT比色試驗(yàn)，每孔加入20?l 5mg/m1的MTT溶液終止培養(yǎng)，在CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h后吸去培養(yǎng)液，再每孔加入150μl DMSO，充分振蕩培養(yǎng)板10min，酶標(biāo)儀在490nm波長下測(cè)定各孔吸光度值。

1.2.3 Western blotting 方法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平：收集各組細(xì)胞后提取蛋白，進(jìn)行Western blotting檢測(cè) Rac1和RhoA的表達(dá)變化

1.2.4 RNA 抽提與定量RT-PCR：細(xì)胞總RNA 提取依照Trizol試劑盒方法進(jìn)行。 Rac1引物：上游引物CAAGTGTGTGGTGGTGGGAG下游引物TCTGTTTGCGGATAGGATAG，擴(kuò)增片段為77bp；RhoA引物：上游引物GACTCGGATTCGTT GCCTGA下游引物TGGGAACTGGTCCTTGCTGA，擴(kuò)增片段為324bp。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃ 30s，變性95℃ 5s，延伸68℃ 30s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線，溶解曲線和Cr值。采用Livak法以β-actin為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用x±s表示，照射組與對(duì)照組及照射組間比較采SPSS12.0進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 ASA對(duì)細(xì)胞活性的影響：不同濃度ASA處理黑素細(xì)胞24h后，以藥物濃度為橫軸，以490nm波長下吸光度值為縱軸繪制圖表。細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果顯示當(dāng)ASA的濃度在100μM以內(nèi)對(duì)細(xì)胞活性沒有影響，而當(dāng)ASA濃度超過500μM時(shí)細(xì)胞活性降低,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，當(dāng)處理濃度為2 500μM時(shí)細(xì)胞活性明顯降低，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）(圖1)。

2.2 ASA對(duì)Rac1，RhoA蛋白表達(dá)的影響：不同處理組中Rac1，RhoA的蛋白表達(dá)變化：經(jīng)100mJ UVB照射后與對(duì)照組相比Rac1蛋白表達(dá)顯著增加，RhoA表達(dá)顯著下降；100mJ UVB照射后即刻給予100μM ASA組與單純UVB照射組相比Rac1蛋白表達(dá)顯著降低，RhoA表達(dá)顯著增高(圖2)。

2.3 ASA對(duì)Rac1，RhoA mRNA表達(dá)的影響：100mJ UVB照射組與對(duì)照組相比Rac1 mRNA表達(dá)顯著增加，而在照射后即刻給予100μM ASA組其表達(dá)明顯下降(圖3)；100mJ UVB照射組與對(duì)照組相比RhoA mRNA表達(dá)顯著降低，而在照射后給予100μM ASA組其表達(dá)明顯增加(圖4)。

3討論

3.1 黑素細(xì)胞分布于表皮基底層，其主要功能是產(chǎn)生黑素，并將其轉(zhuǎn)運(yùn)到鄰近的角質(zhì)形成細(xì)胞。因此樹突是黑素細(xì)胞形態(tài)學(xué)的重要特征性標(biāo)志，它形成樹枝狀分叉，朝鄰近的角質(zhì)形成細(xì)胞生長，以使黑素細(xì)胞將黑素輸送給它們[4]。黑素細(xì)胞可以通過增加其樹突數(shù)量和長度而更有效地向其鄰近的角質(zhì)形成細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)黑素，使色素沉著增加。樹突在黑素轉(zhuǎn)運(yùn)中起著至關(guān)重要的作用，其本身又受到許多因素的調(diào)節(jié)使其自身的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。其中，關(guān)鍵調(diào)控因子是Rho蛋白家族的RhoA和Rac1。Scott等研究發(fā)現(xiàn)，RhoA和Rac1在黑素細(xì)胞肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架和樹突形成方面起重要作用[2]。在黑素細(xì)胞內(nèi)，活化Rac1可以促進(jìn)樹突的形成和延伸，而RhoA具有相反的作用[6]。

3.2 乙酰水楊酸，是環(huán)氧合酶的非特異性抑制劑，具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗風(fēng)濕、抗腫瘤等作用[7-8]。有研究發(fā)現(xiàn)ASA具有淡化炎癥后色素沉著的作用。有文獻(xiàn)報(bào)道COX-2抑制劑能抑制αVβ3調(diào)節(jié)的Cdc42/Rac依賴的內(nèi)皮細(xì)胞的遷移[3]，但Cdc42/Rac并不只與細(xì)胞的遷移相關(guān)，還與黑素細(xì)胞樹突的數(shù)量以及形態(tài)密切相關(guān)，提示COX-2可能通過調(diào)節(jié)Cdc42/Rac的表達(dá)而調(diào)控黑素細(xì)胞樹突形態(tài)以及數(shù)量。

3.3 本研究發(fā)現(xiàn)，ASA可以抑制UVB照射引起的人黑素細(xì)胞系PIG1中Rac1的高表達(dá)；并可以改變UVB照射引起的人黑素細(xì)胞系PIG1中RhoA的低表達(dá)，表明ASA能夠影響黑素細(xì)胞樹突形態(tài)因子RhoA和Rac1的表達(dá)，進(jìn)而影響樹突的形成及功能，減少黑素小體轉(zhuǎn)運(yùn)，從而發(fā)揮淡化色斑的作用。

[參考文獻(xiàn)]

[1]朱東寧,簡(jiǎn)強(qiáng),薛柯,等. UVB照射對(duì)黑素細(xì)胞樹突形態(tài)調(diào)控因子Rac1和RhoA表達(dá)的影響[J].中國美容醫(yī)學(xué),2011,20(6):944-946.

[2]Scott G. Rac and Rho: The story behind melanocyte dendrite formation[J]. Pigment Cell Res, 2002, 15(5):322-330.

[3]Dormond O,Foletti A,Paroz C, et al. NSAIDs inhibit alpha beta 3 integrin-mediated and Cdc4/Rac-dependent endothelial cell spreading, migration and angiogenesis[J]. Nat Med,2001,7(9):1041-1047.

[4]廖非,劉棟.黑素小體轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志,2009，8(2):125-127.

[5]Ito Y,Kanamaru A,Tada A.Centaureidin promotes dendrite retraction of melanocytes by activating Rho[J].Biochim Biophys Acta,2006,1760(3):487-494.

[6 ]Etienne,Manneville S,Hall A.Rho GTPases in cell biology[J].Nature,2002, 420(12):629-635．

[7]高潤霖. 進(jìn)一步加強(qiáng)阿司匹林在心腦血管疾病一級(jí)預(yù)防中的應(yīng)用[J].醫(yī)學(xué)研究雜志, 2008, 37(2):1-2.

[8]Mizokami Y.Efficacy and safety of rabeprazole in non-steroidal anti-inflammatory drug-induced ulcer in Japan[J]．World J Gastroenterol,2009,15(40):5097-50102.

[9]Lee JL,Kim A,Kopelovich L,et al.Differential expression of E prostanoid receptors in murine and human non-melanoma skin cancer[J].J Invest Dermatol,2005,125:8l8-825.

[收稿日期]2011-11-17 [修回日期]2012-01-28

編輯/張惠娟