阿托伐他汀對糖尿病腎病大鼠腎小球細(xì)胞增殖的影響及其意義

尤燕舞 林栩 楊發(fā)奮 王潔

【摘要】 目的 探討阿托伐他汀對糖尿病腎病大鼠腎小球細(xì)胞增殖的影響及意義。方法 將40只SD雌性大鼠隨機(jī)分為四組：糖尿病腎病組（DN組）、預(yù)防組、治療組、對照組，每組10只。DN組、預(yù)防組和治療組糖尿病造模成功后，預(yù)防組和治療組分別給予不同劑量的阿托伐他汀干預(yù)，對照組僅注射檸檬酸緩沖液。第8周測定相關(guān)生化指標(biāo)，觀察腎組織病理改變后，通過免疫組化法分析大鼠腎小球增殖細(xì)胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen，PCNA）的表達(dá)。結(jié)果 預(yù)防組和治療組相關(guān)生化指標(biāo)較DN組好轉(zhuǎn)，腎臟病變減輕，PCNA表達(dá)于腎小球固有細(xì)胞。DN組腎小球中PCNA的表達(dá)均較預(yù)防組、治療組、對照組明顯上調(diào)。而預(yù)防組、治療組腎小球中PCNA的表達(dá)較DN組下調(diào)，且預(yù)防組PCNA的下調(diào)更為顯著。結(jié)論 阿托伐他汀通過下調(diào)腎小球PCNA表達(dá)，抑制腎小球細(xì)胞增殖實現(xiàn)對DN的保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】 阿托伐他?。惶悄虿∧I??；腎小球；細(xì)胞增殖

糖尿病腎病（Diabetic nephropathy，DN）是糖尿病常見的嚴(yán)重并發(fā)癥，最終進(jìn)展至慢性腎功能衰竭，也是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的常見原因。因此，對DN的早期治療以延緩慢性腎臟病的進(jìn)展成為臨床上需要迫切解決的關(guān)鍵問題。阿托伐他汀是以氟苯取代吲哚環(huán)的甲羥戊酸內(nèi)酯的衍生物，是全人工合成的第2個他汀類藥物，無需代謝轉(zhuǎn)化就具有藥理活性。近年研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物的腎保護(hù)作用可能材料與方法

1.糖尿病腎病大鼠模型的建立 清潔級SD雌性大鼠40只購自廣西醫(yī)科大學(xué)，體重在200～250 g之間，采用隨機(jī)原則分為四組：糖尿病腎病組（DN組）、預(yù)防組、治療組和對照組，每組10只。大鼠在SPF級清潔條件下飼養(yǎng)。DN組、預(yù)防組和治療組均單次左下腹腔注射50 mg/kg的鏈尿佐菌素（STZ），注射后連續(xù)三天采集尾靜脈血測血糖濃度，若血糖>16.7 mmol/L說明糖尿病造模成功。預(yù)防組于造模成功后每天給予阿托伐他汀10 mg/kg灌胃；治療組于造模成功后收集24小時尿測定尿蛋白，出現(xiàn)明顯蛋白尿（即第4周）起每天給予阿托伐他汀10 mg/kg灌胃；對照組僅予注射pH=4.5的檸檬酸緩沖液。

2.標(biāo)本收集 第8周用代謝籠收集大鼠24小時尿液以測定尿白蛋白排泄率（Urinary Albumin Excretion Rate，UAER），麻醉方式采用乙醚吸入，經(jīng)心臟取血，離心取血清用以測定血膽固醇（CHO）、肌酐（Scr）、尿素氮（BUN），計算內(nèi)生肌酐清除率（endogenous creatinine clearance rate，Ccr）；切下腎臟，分離包膜后用10%甲醛浸泡固定，制作石蠟塊，以行常規(guī)染色、免疫組化等檢測。

3.光鏡下分析腎臟病理改變 腎組織蠟塊行3 mm切片后行HE、PAS染色，于光鏡下用彩色病理圖像分析系統(tǒng)分析腎臟病理改變。

4.免疫組化檢測 采用免疫組織化學(xué)SP法，3 mm切片用血清封閉，依次滴加一抗為兔來源的多克隆增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG、辣根酶標(biāo)記的鏈酶卵白素液等，PBS替代一抗作陰性對照。DAB染色后于光鏡下用彩色病理圖像分析系統(tǒng)分析其陽性表達(dá)情況，于高倍鏡下（400倍）每張切片連續(xù)取10個腎小球分析腎小球陽性區(qū)域的灰度值并計算陽性細(xì)胞數(shù)。

5.統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（-±s）表示，多組間的比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用q檢驗（Newmankeuls法），P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.生化指標(biāo) DN組大鼠血糖、24小時UAER、血膽固醇、內(nèi)生肌酐清除率、尿素氮水平均較對照組明顯升高（P均<0.01）。而預(yù)防組和治療組的以上指標(biāo)均較DN組降低（P<0.05或0.01），其中預(yù)防組的UAER降低較治療組更為明顯（P<0.05）。

2.光鏡下腎臟病理改變 糖尿病腎病大鼠腎組織表現(xiàn)為以系膜細(xì)胞為主的腎固有細(xì)胞中、重度增生，系膜區(qū)基質(zhì)增生，系膜區(qū)擴(kuò)大，基底膜增厚，腎小球體積明顯增大等改變。預(yù)防組和治療組的上述病理改變較DN組減輕。

3.腎小球中PCNA的表達(dá) PCNA主要表達(dá)于腎小球固有細(xì)胞的細(xì)胞核。在DN組腎小球中PCNA的表達(dá)水平（0.45±0.02）均較預(yù)防組（0.23±003）、治療組（0.36±0.02）、對照組（0.15±0.02）明顯上調(diào)（P<0.05）。而預(yù)防組、治療組大鼠腎組織中PCNA的表達(dá)水平較DN組下調(diào)（P<0.05），其中預(yù)防組大鼠腎組織中PCNA的表達(dá)水平又較治療組下調(diào)（P<0.05）。

討 論

DN是糖尿病嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，是引起我國慢性腎功能衰竭常見的病因，病情復(fù)雜、預(yù)后不良，是臨床治療上較為棘手的疾病。因此，尋找有效的藥物用于糖尿病腎病的早期治療非常重要。阿托伐他汀為HMGCoA還原酶選擇性抑制劑，可顯著改善內(nèi)皮功能，改善腎功能，其作用是通過非降脂依賴性機(jī)制，而且效果與劑量相關(guān)[1]。幾項臨床研究證實阿托伐他汀可在糖尿病腎病患者中發(fā)揮治療作用[2～4]，但其作用機(jī)制尚不明確。增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的關(guān)鍵因子，其在靜止期細(xì)胞中表達(dá)很少，在G晚期開始增高，通常在S期達(dá)高峰，到M期則開始明顯下降，其作為DNA聚合酶6的輔因子，參與調(diào)節(jié)DNA合成，與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，是評價細(xì)胞增殖活性的可靠指標(biāo)。劉靜等人[5]在糖尿病腎病大鼠腎組織中檢測PCNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PCNA顯著高于對照組，因此認(rèn)為其在糖尿病腎病的發(fā)生、進(jìn)展中起著重要作用。我們前期已經(jīng)證實，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的關(guān)鍵因子——細(xì)胞周期素和周期素依賴性激酶參與了糖尿病腎病中腎固有細(xì)胞的增殖，說明細(xì)胞增殖在糖尿病腎病的發(fā)生、進(jìn)展中起著重要作用[6]。

本文通過對大鼠腹腔注射STZ成功制備了糖尿病模型，分別在糖尿病早期未出現(xiàn)腎臟病變時和合并腎病后給予阿托伐他汀治療，觀察阿托伐他汀預(yù)防用藥和治療用藥后相關(guān)生化指標(biāo)、腎臟病理改變及腎小球中PCNA的表達(dá)變化，以探討阿托伐他汀對DN的預(yù)防和保護(hù)作用及其通過影響細(xì)胞增殖發(fā)揮的非依賴降脂作用機(jī)制。第8周大鼠腎組織符合DN病理表現(xiàn)，血糖、膽固醇明顯升高，出現(xiàn)蛋白尿，腎功能出現(xiàn)損害，腎小球中細(xì)胞增殖的同時PCNA的表達(dá)明顯上調(diào)。給予阿托伐他汀治療后腎臟病變減輕，血糖、膽固醇下降，蛋白尿、腎功能損害減輕，腎小球中PCNA的表達(dá)減少，且早期預(yù)防用藥對減少蛋白尿和下調(diào)腎小球中PCNA表達(dá)的作用較治療用藥更為顯著。由此說明阿托伐他汀對DN具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制部分是通過下調(diào)腎小球PCNA表達(dá)，抑制細(xì)胞腎小球細(xì)胞增殖而實現(xiàn)的，早期用藥效果更佳。

綜上所述，阿托伐他汀通過下調(diào)腎小球PCNA表達(dá)，抑制細(xì)胞腎小球細(xì)胞增殖實現(xiàn)對DN的保護(hù)作用。但阿托伐他汀在DN治療中可能還存在其他作用機(jī)制，如對增殖以外的細(xì)胞周期等的影響還有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1]Shepherd J，Kastelein JJ，Bittner V，et al.Effect of intensive lipid lowering with atorvastatin on renal function in patients with coronary heart disease： the Treating to New Targets （TNT） study[J].Clin J Am Soc Nephrol，2007，2（6）：11311139.

[2]周 利，賀祿碧.前列地爾聯(lián)合阿托伐他汀治療早期糖尿病腎病療效觀察[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)刊，2012，14（4）：649650.

[3]吳志堅.阿托伐他汀聯(lián)合替米沙坦防治早期糖尿病腎病的療效觀察[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥，2012，19（2）：5556.

[4]鐘 誠，徐 耕，金紅峰，等.阿托伐他汀對冠心病伴糖尿病患者的腎臟保護(hù)作用的臨床觀察[J].心腦血管病防治，2012，12（2）： 97100.

[5]劉 靜，陳昕麗，竇玉娟，等.增殖細(xì)胞核抗原在實驗性糖尿病腎病大鼠腎組織表達(dá)中的意義[J].華北煤碳醫(yī)學(xué)院學(xué)報， 2011， 13（2）： 162163.

[6]尤燕舞，林 栩，楊發(fā)奮，等.糖尿病腎病大鼠腎組織周期素D1與周期素依賴性激酶4的表達(dá)及意義[J].右江醫(yī)學(xué)，2008，36（3）： 245247.